종양 표적 영상 및 치료를 위한 다기능 금 나노입자의 신속하고 친환경적인 원스텝 합성

결과 및 토론

DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP의 합성 및 특성화

DOX-GNPs 합성에서 DOX와 염화금산 용액의 혼합 용액에 NaOH 용액을 가하면 용액의 색이 즉시 주황색에서 옅은 보라색으로 바뀌고 100 °C에서 와인 레드가 되었다. DOX-GNP의 형성을 나타내는 1분 내에 자기 교반 하에서 환류 시스템. 결과는 DOX가 염기성 조건에서 강한 환원성을 갖는 2개의 페놀성 수산기(6번 및 11번 탄소)를 보유하기 때문에 DOX의 환원능이 매우 강함을 나타냈다. 색이 변하지 않을 때까지 30분간 반응을 계속하였다.

DOX의 오렌지 레드 색상과 GNP의 와인 레드 색상을 혼동하지 않도록 UV 흡수 스펙트럼을 특성화하여 더 많은 증거를 제시합니다(그림 1a 참조). DOX는 485 nm 근처에서 특징적인 흡수 피크를 갖고 530 nm에서 피크를 나타냅니다. 그러나 480 nm의 피크는 제품 용액의 스펙트럼에서 사라지고 520 nm의 특징적인 피크는 GNP의 특성 표면 플라즈몬 공명(SPR) 흡수 피크가 나타났습니다. 그럼에도 불구하고 GNPs의 형성은 GNPs의 520nm와 DOX 피크의 530nm 사이에서 아직 완전히 결정되지 않았습니다. GNP가 고속 원심분리로 침전되고 DOX 분자는 침전되지 않는다는 점을 고려하면 원심분리관 바닥의 생성물에서 보라색 침전물을 볼 수 있습니다(그림 1a(3-4) 삽입) 및 DOX는 둘 중 하나가 없습니다(그림 1a(1-2) 삽입).

아 DOX 및 준비된 DOX–GNP의 UV-가시광 흡수 스펙트럼, (a 삽입 )는 원심분리 전(1, 3)과 원심분리 후(2, 4)의 DOX(1, 2) 및 DOX-GNP(3, 4)의 이미지입니다. ㄴ DOX-GNP의 TEM 이미지. ㄷ DOX 및 준비된 DOX-GNP의 FTIR 스펙트럼. d DOX–GNP의 XPS 스펙트럼

DOX는 365 nm 자외선 조사에서 적색 형광을 나타냅니다. 그러나 DOX의 형광은 GNP 합성 후에 사라졌습니다. 두 가지 가능한 이유가 있습니다. 첫 번째는 한나라당의 소광계수가 매우 강하여 한나라당의 표면(<5 nm)에 가깝게 위치할 때 분자의 형광을 소멸시키는 경향이 있다는 것입니다[40]. 거리가 20 nm 이상으로 증가하면 나노 입자의 플라즈몬 필드가 너무 멀어 형광 신호를 소멸시킬 수 있습니다 [41]. 또 다른 이유는 환원제 역할을 한 후 DOX의 형광기가 파괴되었기 때문입니다. 그림 1c에서 볼 수 있듯이 DOX-GNP의 적외선 흡수 피크의 수는 DOX보다 현저히 적지만 2910cm에서 특징적인 IR 흡수 피크와 같은 DOX의 많은 특성이 여전히 유지되었습니다. ⁻¹ (C-H, 신축 진동) [42], 1631cm ⁻¹ (카르보닐 스트레치 진동) [43], 1114 cm ⁻¹ (C-O, C-N 신축진동) [44], 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, 면외 굽힘 진동) [45], 각각. DOX의 대표적인 피크는 DOX-GNP의 스펙트럼에도 표시되어 DOX가 DOX-GNP에 성공적으로 결합되었음을 나타냅니다. 흥미롭게도 1214cm ⁻¹ 에서 피크 페놀성 수산기[46]의 C-O 신축 진동에 대한 특성 피크는 DOX-GNP의 스펙트럼에서 사라졌습니다. 페놀 그룹은 Au 이온을 GNP로 환원시킨 다음 카보닐 그룹으로 수송할 수 있습니다. 우리는 DOX가 탄소 7의 아미노기와 탄소 9의 하이드록실기에 의해 DNA에 내장되기 때문에 DOX의 효과가 영향을 받지 않는다고 추측합니다[39].

DOX-GNP의 입자 크기는 TEM 결과에서 약 6 nm임을 관찰할 수 있습니다(그림 1b). Au(I)의 계산된 비율은 DOX-GNP의 XPS 스펙트럼에서 31.93%였으며(그림 1d), 이는 콜로이드의 안정성을 유지하기에 충분히 높습니다. 그러나 0.2M PBS 완충용액에 분산된 DOX-GNPs를 상층액을 제거한 후 고속 원심분리하여 침전시키면 이 용액의 색이 보라색이 되고 불용성 플록이 가시적으로 보였다. DOX-GNP의 안정성은 높은 염 농도 환경에서 그다지 좋지 않음을 나타냅니다. DOX는 Au-S와 Au-N 결합을 통해 GNP의 표면을 연결하기에 충분하지 않은 하나의 아미노 그룹만 가지고 있지만 sulfhydryl 그룹은 가지고 있지 않다고 설명할 수 있습니다. 따라서 DOX-GNP가 종양 영상 및 치료를 위한 조영제 및 항종양 물질로 사용된다면 더 많은 노력이 필요합니다.

우리는 환원제와 안정화제로 DOX, RGD 펩타이드 및 NLS 펩타이드를 사용하여 DRN-GNP를 합성했습니다. RGD 펩타이드는 α_v를 과발현한 일부 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있습니다. β₃ 인테그레인 및 NLS 펩티드는 핵을 특이적으로 표적화할 수 있습니다. 그림 2a는 제작된 DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP의 UV-Vis 스펙트럼을 보여줍니다. 표면 플라즈몬 흡수 피크의 특성은 520–530 nm[33]였습니다. 삽입도에서 GNP가 밝은 레드 와인 색상을 나타냄을 알 수 있습니다. TEM 이미지(추가 파일 1:그림 S1)는 NLS-GNP 및 DRN-GNP의 입자 크기가 약 10nm 및 5nm이고 GNP가 균일하게 분포되어 있으며 명백한 응고가 발견되지 않음을 보여줍니다.

아 자외선 가시광선 흡수 스펙트럼 및 DOX–GNP의 사진 이미지(a ), NLS-GNP(b ) 및 DRN-GNP(c ). ㄴ 기본 DOX, RGD 펩타이드, NLS 펩타이드 및 DRN-GNP의 상등액의 UV-가시광 흡수 스펙트럼. ㄷ NLS 펩티드, NLS-GNP 및 DRN-GNP의 FTIR 스펙트럼. GNP의 스펙트럼과 NLS 펩타이드의 스펙트럼 사이의 거리가 대조를 위해 확대됩니다.

NLS-GNP와 DRN-GNP의 합성을 검증하기 위해 우리는 그림 2c의 NLS 펩티드와 GNP의 FTIR 스펙트럼을 특성화했습니다. NLS 펩티드의 일부 FTIR 피크는 C-H 신축 진동 흡수 피크(2840–2972 cm ^-1 )와 같은 NLS-GNP 및 DRN-GNP의 스펙트럼에서 발견되었습니다. ) [47], C=O 신축 진동 흡수 피크(1630–1700 cm ^-1 ) [48] 및 =C-H 면내 굽힘 진동 피크(1300–1475 cm ⁻¹ ) [49]; CCYNLS 펩타이드가 GNP의 표면에 성공적으로 접합되었음을 나타냅니다. 우리는 또한 1529 cm ⁻¹ 에서 NLS 펩타이드에서 티로신 말단의 벤젠 골격 진동 피크를 발견했습니다. 및 1193 cm ^-1 에서 페놀성 수산기 C-O 신축 진동 피크 [49] NLS-GNP와 DRN-GNP의 적외선 스펙트럼에서 사라졌는데, 이는 티로신 말단의 벤젠 골격이 환원제 역할을 한 후 퀴논 구조로 이동되었음을 의미한다.

우리는 고속으로 DRN-GNP를 원심분리하고 거의 무색인 상등액을 수집한 다음 그림 2b의 UV-Vis 스펙트럼을 통해 잔류 반응물이 있는지 테스트했습니다. RGD 및 NLS 펩타이드의 UV 흡수 피크는 티로신 잔기에서 유래되었으며, 흡수 피크는 275 nm에 위치했습니다. 그러나 페놀성 수산기는 알칼리 조건하에서 음의 산소이온이 되어 벤젠고리의 전자밀도를 증가시키며 피크는 292 nm로 적색으로 이동하였다. 우리는 DRN-GNP의 상층액의 UV-Vis 스펙트럼에서 특징적인 피크를 보지 못했는데, 이는 두 펩타이드가 모두 반응에 참여했음을 의미합니다. DOX는 450-600 nm 범위에서 3개의 흡수 피크를 가지고 있지만 DRN-GNP의 상층액에는 이러한 피크가 없습니다. 또한 DRN-GNP의 상등액에서는 DOX가 발견되지 않았는데, 그 이유는 DRN-GNP의 색이 연한 갈색이었지만 기본 조건에서 DOX의 색은 투명한 연보라색이었기 때문입니다. 세 가지 물질이 거의 완전히 반응한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 유사하게, DR-GNP 및 DN-GNP도 이러한 방식으로 설명됩니다(추가 파일 1:그림 S2 참조).

우리는 XPS 분광법을 사용하여 NLS-GNP 및 DRN-GNP에 대한 Au의 원자가를 조사했습니다. 그림 3a, b에서 볼 수 있듯이 약 83.6 eV 및 87.0 eV의 결합 에너지를 갖는 두 피크는 Au 4f7/2 및 4f 5/2 광전자 방출과 일치합니다[33]. 두 GNP의 Au 4f7/2 결합 에너지 위치는 거의 84.0 eV입니다. NLS-GNP의 경우 Au(0)(83.5eV) 및 Au(I)(84.1eV)로 디컨볼루션될 수 있으며 피크 면적 비율은 각각 57% 및 43%입니다. 유사하게, DRN-GNP의 경우 Au(0)(83.6 eV) 및 Au(I)(84.4 eV)로 디컨볼루션될 수 있으며, 피크 면적 비율은 각각 62% 및 38%이므로 더 높은 비율을 갖습니다. Au (I). 전하는 한나라당의 콜로이드 안정성을 유지하는 데 도움이 되는 Au(I)-S 착물을 형성할 수 있습니다. 흥미롭게도 우리는 추가 파일 1:그림 S3에서 NLS-GNP, DN-GNP 및 DRN-GNP의 XPS 스펙트럼에서 세 가지 유형의 S를 식별했습니다. 파란색과 검은색 곡선은 황의 산화 상태를 나타내고 보라색 곡선은 S-H 결합을 나타내며 녹색 곡선은 Au-S 결합을 나타냅니다. Au-S 결합의 형성은 NLS 펩타이드가 이 세 GNP의 표면에 성공적으로 접합되었음을 보여줍니다.

(a의 Au 4f의 XPS 스펙트럼 ) NLS-GNP, (b ) DRN-GNP. 원래 스펙트럼(검정색)의 Au 4f7/2 결합 에너지와 피팅된 결과(빨간색)는 Au(0)-파란색 곡선과 Au(I)-보라색 곡선의 두 가지 구성 요소로 분해될 수 있습니다. PBS, NaCl, NaOH 및 HCl에 각각 분산된 DRN-GNP의 UV-가시광 흡수 스펙트럼 및 이미지(c ).

또한 XPS 스펙트럼의 N 1s, C 1s 및 O 1s 피크는 펩타이드와 DOX가 GNP에 부착되었음을 보여줍니다(추가 파일 1:그림 S4).

XRD 스펙트럼(추가 파일 1:그림 S5)은 모든 XRD 스펙트럼이 38.2°, 44.5°, 64.7° 및 77.8°에서 4개의 피크를 포함하기 때문에 이러한 GNP의 결정 구조가 면심입방 결정 구조임을 보여줍니다. (111), (200), (220), (311) 평면 [33]에 해당합니다.

DRN-GNP의 안정성

이들 5개 GNP의 동적 광산란(DLS) 및 제타 전위 데이터는 표 1에 표시되었습니다. 그들의 유체역학적 크기는 수용성 GNP의 핵심 주위에 일정량의 수화된 분자에 기인할 수 있는 TEM에 의해 특징지어지는 것보다 더 큽니다. 그들의 제타 전위는 GNP의 표면에 결합된 카르복실기 때문에 음수였습니다. GNP 용액은 제타 전위의 절대값이 30mV보다 클 때 우수한 콜로이드 안정성을 나타냅니다. 절대값이 클수록 안정성이 좋습니다. 표 1에서 모두 우수한 콜로이드 안정성을 가지고 있음을 알 수 있습니다. 이에 비해 NLS-GNP의 제타 전위 값이 가장 높았습니다. 이는 표면이 티올 그룹. DOX-GNP의 제타 전위의 절대값은 30mV에 가까웠습니다. DOX-GNP가 PBS 완충 용액에 분산되었을 때 매우 안정적이지 않았다는 이전에 언급된 것과 일치합니다. 스펙트럼 데이터는 추가 파일 1:그림 S6에 표시되었습니다.

GNP의 특징적인 표면 플라즈몬 공명(SPR) 밴드의 변화는 UV-Vis 분광법을 활용하여 GNP의 응집을 결정하는 데 사용할 수 있습니다[49]. 우리는 UV-Vis 스펙트럼을 측정하고 DRN-GNP가 고염(1M NaCl 및 0.2M PBS), 강산(0.5M HCl) 및 강염기( 0.5M NaOH) 용액. HCl 용액의 색이 약간 보라색으로 변하고 자외선 흡수 피크가 약 20 nm로 빨간색으로 이동하는 HCl 용액을 제외하고 다양한 가혹한 조건에서 용액 색상 변화 및 UV-vis 스펙트럼 이동이 관찰되지 않았습니다. 이는 GNP가 강산 조건에서 약간 응고되었음을 의미합니다. . 그 이유는 음전하를 띤 GNPs 콜로이드 안정성이 강한 산성 조건에서는 영향을 받았지만 중성 PBS 완충액과 알칼리 환경에서는 영향을 받지 않았기 때문일 수 있습니다. 우리는 DRN-GNP가 높은 염분 및 알칼리 조건에서 매우 안정적이라는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 합성된 DRN-GNP가 시험관내 세포 영상화 및 생체내 항종양 요법에 사용될 것으로 예상되었음을 나타냅니다.

종양 세포 및 세포 TEM 현미경의 플라즈몬 암시야 산란 영상

DRN-GNP를 사용한 종양 세포의 특정 표적 영상화를 위해 Hela 세포를 테스트 그룹으로 선택하고 MCF-7 세포를 대조군으로 선택했습니다. 그 이유는 Hela 세포가 인테그린 α_v를 과발현하기 때문입니다. β₃ 그러나 MCF-7 세포는 그렇지 않으므로 RGD에 특이적인 결합이 없습니다. 좋은 대조군이다[51]. 35㎍/mL의 최종 농도로 24시간 동안 인큐베이션한 후 이들 두 세포주에 의한 DRN-GNP의 흡수는 암시야 모델에서 직립 형광 현미경으로 평가되었습니다. GNP 없이 처리되는 세포는 플라즈몬 광산란을 나타내지 않습니다(그림 4 A-Hela 세포, 5C-MCF-7 세포). DRN-GNP로 처리되는 Hela 세포의 이미지는 GNP의 산란 신호가 핵에 심하게 국한되어 있음을 보여줍니다(그림 4b 및 5e). 그러나 MCF-7 세포를 DRN-GNP와 함께 배양한 후 산란광을 거의 볼 수 없었습니다. 비록 적은 양의 GNP가 종양 세포의 수동 강화 투과 및 보유 효과를 통해 종양 세포에 들어갔을지라도 effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

아 Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). ㄴ The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). ㄷ Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)