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친환경 마이크로플라즈마 합성 황색 발광 탄소 양자점: 암세포 이미징 및 광촉매 불활성화 응용

초록

최근 진단과 치료 기능을 결합한 다기능 나노입자가 나노의학에서 큰 가능성을 보이고 있습니다. 본 연구에서는 o-페닐렌디아민을 사용하여 마이크로플라즈마로 형광 탄소 나노점인 탄소 양자점(CQDs)을 환경 친화적으로 합성했다고 보고합니다. 생성된 CQDs는 380-500 nm에서 넓은 흡수 피크를 보이며 550 nm에서 밝은 황색 형광을 방출했습니다. CQDs는 HeLa 암세포에 빠르게 흡수되었습니다. 청색광 여기 시 밝은 황색 형광 신호와 강한 활성산소종(ROS)이 효율적으로 생성되어 동시 형광 암세포 이미징과 광역학적 불활성화를 가능하게 했으며, 상대적 세포 생존율이 40% 감소했습니다. 또한 암흑 조건에서 400 μg mL⁻¹ CQDs와 배양 후 약 98% 세포가 활성 상태였으며, 이는 CQDs의 우수한 생체적합성을 보여줍니다. 따라서 새롭게 제조된 CQDs는 체내 바이오이미징과 이미징 유도 암 치료에 효과적이고 안전한 소재임이 입증되었습니다.

서론

암은 여전히 전 세계 주요 사망 원인 중 하나입니다[1]. 진단과 치료 기능을 모두 가진 다기능 나노입자는 나노의학에서 유망한 응용을 가집니다. 동시 이미지 유도 치료는 암 치료의 새로운 개념으로 치료 효율 최적화에 큰 가능성을 보입니다. 종양의 크기와 위치, 광치료의 최적 시간 창, 치료 효능에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다[2-4]. 광역학 치료(PDT)는 시공간적 선택성과 비침습적 특성으로 많은 암과 다른 질병 치료에 사용되어 왔습니다[5, 6]. 이상적인 광감작제는 일반적으로 다음 특성을 가집니다: (1) 높은 효율의 활성산소종(ROS) 생성, (2) 좋은 생체적합성, (3) 물 용해성[7]. 그러나 현재 PDT 응용은 광감작제의 낮은 물 용해성, 불안정성, 비최적 여기 파장으로 제한됩니다. 따라서 환경 친화적이고 저비용인 방법으로 좋은 물 용해성과 생체적합성을 가진 광감작제 대체물질을 생성할 필요가 있습니다.

탄소 양자점(CQDs)은 단순하고 환경 친화적인 합성, 낮은 독성, 뛰어난 생체적합성, 우수한 물 용해성, 광 안정성 등 독특한 유익한 특성으로 엄청난 주목을 받아왔습니다[8]. CQDs는 세포 이미징, 바이오센싱, 표적 약물 전달, 기타 생물의학 응용에 잠재적 용도가 있습니다[9-13]. 탄소 점 합성에는 탑다운과 바텀업 두 가지 주요 접근법이 있습니다. 탑다운 방법에는 전기화학적 산화, 레이저 절제, 화학적 산화, 초음파 합성 방법이 포함됩니다. 바텀업 방법에는 수열 처리, 마이크로파 합성, 열분해가 포함됩니다[14-17]. 그러나 필요한 고온, 고압, 강산은 항상 상당한 에너지 소비, 복잡한 공정, 환경에 대한 불가피한 해를 초래합니다. 따라서 새로운 환경 친화적 합성 방법이 시대의 요구로 등장했습니다. 보고된 바와 같이, CQDs는 고온 조건, 큰 에너지 입력, 번거로운 절차 없이 마이크로플라즈마-액체 방법을 사용하여 단 몇 분 만에 생성될 수 있습니다[18-20]. 마이크로플라즈마는 기초 연구와 첨단 소재 응용 모두에 독특한 물리화학적 환경을 제공합니다. 마이크로플라즈마가 제공하는 화학적, 전자적 환경은 고도로 비평형 상태이며 에너지를 저장할 수 있습니다. 이 환경에서 다수의 전자, 이온, 자유 라디칼, 기타 여기-이온화-활성 물질이 생성될 수 있습니다[21, 22]. o-페닐렌디아민은 탄소 나노점 합성의 원료이지만, 마이크로플라즈마 합성에는 사용되지 않았습니다[23-25].

본 연구에서는 o-페닐렌디아민을 원료로 마이크로플라즈마 처리로 CQDs를 합성했습니다. 이 방법으로 생성된 CQDs는 크기가 균일(직경 약 3.2 nm)하며 약 550 nm에서 방출 피크를 보였습니다. 새롭게 합성된 CQDs가 광 조건에서 대량의 ROS를 생성할 수 있음을 입증했습니다. 체외에서 CQDs는 HeLa 종양 세포에 흡수되어 420-500 nm 청색 파장 여기 시 황색광을 방출하며 낮은 독성을 보였습니다. 또한 460 nm 조사 하에서 HeLa 종양 세포의 불활성화를 관찰했습니다. 이러한 결과는 새롭게 제조된 CQDs가 체내 바이오이미징, 이미징 유도 또는 표적 암 치료를 위한 유망한 소재일 수 있음을 시사합니다.

결과 및 고찰

CQDs 특성 분석

본 연구의 황색 발광 CQDs는 마이크로플라즈마 방법을 사용하여 o-페닐렌디아민을 탄소 전구체로 하여 쉽고 환경 친화적인 방식으로 제조되었습니다. 마이크로플라즈마 처리 방법이 탄소 나노점 합성에 사용된다고 보고되었지만, 관련 연구는 드뭅니다. 그림 1A는 CQD 입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 보여줍니다. 마이크로플라즈마로 생성된 입자는 원형 또는 타원형이며 평균 직경 3.2 nm입니다. 고분해능 이미지(그림 1A 인셋)에서 CQDs의 격자 거리는 0.21 nm로 흑연의 (1,1,0)면에 속합니다. 라만 스펙트럼은 D 모드(무질서 유도 모드)가 1342 cm⁻¹ 근처, G 모드가 1507 cm⁻¹ 근처에 위치함을 보여주며, 이는 탄소의 sp³ 및 sp² 혼성화 결과입니다(그림 1E). D 모드 강도가 G 모드에 비해 시료 내 흑연 미세결정 크기에 의존한다는 것은 알려져 있습니다. 시료의 무질서도가 높을수록 ID/IG 강도 비율이 높아지고 흑연 미세결정은 작아집니다. 또한 CQD 분말의 D 및 G 모드는 상대적으로 높은 ID/IG 강도 비율(0.77)을 가진 작은 흑연 플레이크로 볼 수도 있습니다.

친환경 마이크로플라즈마 합성 황색 발광 탄소 양자점: 암세포 이미징 및 광촉매 불활성화 응용
CQDs 특성 분석. A CQDs TEM 이미지(인셋, 고분해능 TEM); B CQDs 크기 분포; C CQDs UV-vis 흡수 스펙트라; D 400-500 nm 여기 파장에서 20 nm 간격으로 측정한 CQDs 형광 스펙트럼; E, F CQDs 라만 스펙트럼 및 FTIR 스펙트럼

FTIR과 XPS는 탄소 기반 소재의 화학적 조성과 구조를 특성화하는 강력한 도구입니다. CQDs의 FTIR 데이터는 400-4000 cm⁻¹ 범위에서 기록되었습니다(그림 1F). FTIR 스펙트럼은 CQDs가 주로 아민(3052, 3324 cm⁻¹), OH(3200 cm⁻¹), C=O(1595 cm⁻¹), C-N/C-O(1200 cm⁻¹), C=C(1500 cm⁻¹), CH(748 cm⁻¹) 작용기나 화학 결합을 포함함을 보여줍니다[26, 27]. XPS로 결정된 CQDs 표면 성분은 FTIR 결과와 일치했습니다. 그림 2A에 제시된 전체 스펙트라에는 세 가지 전형적 피크가 있습니다: C 1s(285 eV), N 1s(400 eV), O 1s(531 eV).

친환경 마이크로플라즈마 합성 황색 발광 탄소 양자점: 암세포 이미징 및 광촉매 불활성화 응용
CQDs XPS 스펙트라. A CQDs 전체 XPS 스펙트라; B C 1s 고분해능 스펙트럼; C N 1s 고분해능 스펙트럼; D O 1s 고분해능 스펙트럼

그림 2B-D에서 C 1s 분석은 sp²/sp³ 탄소(C-C/C=C, 284.8 eV), 질소 함유 탄소(C-O/C-N, 285.9 eV), 카르보닐 탄소(C=O, 287.7 eV) 존재를 보여줍니다. N 1s 밴드는 399.3, 400.3, 401.7 eV에서 세 피크로 디컨볼루션되며, 각각 피롤릭 N, 그래피틱 N, 아미노 N에 해당합니다. O 1s 밴드는 C-O(531.6 eV)와 C=O(533.1 eV) 피크를 포함합니다[28, 29]. 중요하게도, 이러한 작용기의 존재는 CQDs에 우수한 용해도를 부여했습니다. 또한 CQDs의 광학적 특성은 형광 분광법과 UV-Vis 흡수로 조사했습니다. CQDs의 형광 방출 스펙트라는 그림 1C에 나와 있습니다. 제조된 CQDs는 여기 의존적 형광 방출 거동을 보입니다. 400-500 nm에서 여기 시 최대 형광 방출 피크가 473에서 519 nm로 적색 이동하고 형광 강도가 급격히 감소합니다[30]. 그림 1D에서 CQDs의 UV-vis 스펙트라는 400-490 nm 파장 범위에서 강한 흡수 피크를 특징으로 합니다. CQDs는 280 nm와 420 nm에서 두 가지 특성 흡수 피크를 보이며, 각각 π-π*(방향족 C=C)와 n-π*(카르복실 및/또는 C-N) 전이에 기인합니다[31, 32]. 따라서 이러한 CQDs의 광학적 특성은 동시 생물학적 이미징과 광역학적 불활성화의 실행 가능성을 제공합니다.

CQDs의 바이오이미징 및 세포독성

CQDs의 바이오이미징 및 세포 표지 능력을 평가하기 위해, 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 HeLa 세포에서 CQDs를 이용한 체외 세포 이미징을 조사했습니다. HeLa 세포를 200 μg mL⁻¹ CQDs와 6시간 배양한 후 CLSM 검출을 위해 준비했습니다. 결과적으로 HeLa 세포 전체에 밝은 황색 형광이 고르게 분포하여 나타났습니다(그림 3A). 더 중요하게는, 200 μg mL⁻¹의 낮은 CQDs 농도만으로도 HeLa 세포를 황색 형광으로 표지할 수 있었으며, 이는 CQDs의 세포 이미징 가능성을 더욱 구체화했습니다. 보고된 바와 같이, 탄소 나노입자는 항상 청색광 영역에서만 강한 방출을 보였으며, 장파장 방출은 보통 약했습니다. 자외선 여기 시 생체 조직은 자주 청색 자가형광을 보이고 광손상에 취약하여, 단파장 방출 탄소 나노입자의 생물학적 이미징 분석 응용을 심각하게 저해합니다[33]. 따라서 장파장 방출 탄소 나노입자 개발이 널리 관심받아 왔습니다. 본 연구에서 제조된 CQDs는 400-450 nm 광 여기 시 밝은 황색 형광을 보였습니다. 여기된 황색 형광은 이로써 CQDs가 깊은 위치 종양 검출에 사용될 수 있게 할 수 있습니다. 그러나 인간 암 이미징 실제 응용까지는 아직 갈 길이 멉니다.

친환경 마이크로플라즈마 합성 황색 발광 탄소 양자점: 암세포 이미징 및 광촉매 불활성화 응용
CQDs 응용. A CQDs로 표지된 HeLa 세포 CLSM 이미징; B CQDs 체외 세포독성 테스트; C 대조 용액 또는 CQDs(200 μg mL⁻¹)와 배양된 HeLa 세포의 상대 생존율, 청색광(460 nm, 30 mW cm⁻²) 5, 10, 15분 조사 후; D 청색광 10분 및 15분 조사 후 흥분된 CQDs의 HeLa 세포에 대한 IC50 (*P < 0.05)

발광 특성 외에도, CQDs가 잠재적 바이오 표지 시약으로 개발되려면 높은 생체적합성과 낮은 독성이 항상 요구됩니다. 생물의학 응용을 위해 소재는 권장 용량에서 높은 생체적합성이어야 합니다. 세포독성을 조사하기 위해 HeLa 세포를 0-400 μg mL⁻¹ 범위의 최종 농도 CQDs로 24시간 처리했습니다. 그림 3B에서 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸릴-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석 결과 95% 이상 세포가 생존하여 CQDs가 실질적으로 무독성임이 밝혀졌습니다.

이 데이터는 여기된 황색 형광을 가진 새롭게 생성된 CQDs가 낮은 세포독성과 높은 생체적합성을 가지며, 생물학적 이미징의 유망한 전망을 촉진함을 시사합니다.

광역학 치료 효능

암세포 불활성화

그림 3C에서 CQDs 단독 또는 청색광 단독 처리 시 HeLa 세포 생존율에 차이가 없었습니다. CQDs와 청색광 동시 처리는 광노출 지속시간에 의존하여 HeLa 세포 생존율을 현저히 감소시켰습니다. 460 nm에서 15분 조사 후 CQDs는 놀라운 항종양 활성을 보였으며, 200 μg mL⁻¹ 농도에서 HeLa 세포 생존율이 약 40% 감소했습니다. 흥분된 CQDs의 효과를 추가로 조사하기 위해 MTT 분석을 수행하여 흥분된 CQDs의 HeLa 세포에 대한 반수 억제 농도(IC50)를 평가했습니다. 결과적으로 10분 조사 후 흥분된 CQDs의 HeLa 세포에 대한 IC50은 약 427.5 μg mL⁻¹(95% CI 366.7-498.7 μg mL⁻¹)이었고, 15분 청색광 노출 후 약 255.1 μg mL⁻¹(95% CI 220.9-249.8 μg mL⁻¹)이었습니다.

이 결과는 흥분된 CQDs가 Photofrin[34] 같은 일부 임상 항암제처럼 종양 세포를 효과적으로 죽일 수 있음을 나타내며, CQDs의 이미징 유도 항종양 치료에서 유망한 가치를 보여줍니다.

CQDs의 ROS 생성

PDT 동안, 내포된 광감작제가 적절한 조사 조건 하에서 생성한 세포독성 ROS에 의해 암세포가 죽습니다[35, 36]. ROS는 PDT에서 여러 질병에 대해 거의 부작용 없이 아폽토시스나 괴사로 표적 세포를 불활성화할 수 있습니다[37-40]. 그림 4A 검사에서 ROS 시약이 적색 형광을 방출하여 ROS 생성을 나타냈습니다. 또한 ROS의 적색 신호가 CQDs 형광과 잘 중첩되어, ROS 생성이 종양 세포의 CQDs 섭취와 밀접하게 연관됨을 의미합니다. 그림 4B에서, 대조군 및 레이저 비조사 그룹과 비교하여, 460 nm 레이저로 15분 조사한 실험 그룹에서 뚜렷한 ROS 생성이 관찰되었습니다. 우리 결과는 CQDs가 460 nm 레이저 조사 하에서 세포내 ROS 생성을 현저히 촉진할 수 있으며 PDT 응용에 큰 잠재력이 있음을 나타냈습니다. 원칙적으로, CQDs는 바닥 상태(S0, 그림 4C)에서 여기 상태(Sn, 그림 4C)로 여기될 수 있으며, 이 과정의 효율은 광원 강도와 소멸 계수에 의해 결정됩니다. 용매 매개 완화 후, CQDs는 제1 단일항 여기 상태(S1, 그림 4C)의 최저 진동 준위에 머무릅니다. 여기 후 빠른 진동 완화로 인해 제1 단일항 여기 상태(S1)에서 방출된 광자 에너지는 여기 광자 에너지보다 낮아 파장 증가를 초래합니다. 형광 이미징은 CQDs의 S0 → Sn → S1 전이를 이용합니다[41]. CQDs는 HeLa 종양 세포에 섭취되어 적절한 파장 광원으로 조명 시 형광을 방출하여 세포 표지를 가능하게 합니다. S1은 형광에 의해 S0 상태로 돌아가거나, 비형광 삼중항 여기 상태(T1, 그림 4C)로 계간 교차를 통해 돌아갈 수 있습니다[7, 42]. T1의 형광 그룹은 전자 전달 반응에서 특히 활성화되어 초산화 자유 라디칼을 생성하고 결과적으로 형광 그룹 분해를 초래합니다. T1에서 분자 산소로 전달된 에너지는 바닥 상태 분자 산소보다 강한 여기 단일항 산소 산화제를 생성합니다. 초산화 라디칼과 단일항 산소, 그리고 OH와 H₂O₂를 포함한 다른 ROS는 인근 생물학적 분자와 반응하여 광독성을 발휘하여 세포 사멸을 유도합니다. CQDs가 HeLa 세포에 섭취된 후, 조명은 단일항 상태에서 삼중항 상태로 계간 전이를 통한 전이를 초래했고, 에너지 전달 과정은 ROS를 생성하여 궁극적으로 세포 사멸로 이어졌습니다. 적절한 파장 광원 하에서 CQDs는 두 가지 유형의 에너지 전이를 겪습니다. 형광은 HeLa 종양 세포를 표지하기 위해 방출되었고, HeLa 세포는 ROS에 의해 죽었습니다. 우리 실험 데이터는 암흑 조건에서 새로 생성된 CQDs의 좋은 생체적합성과 광 조건 하 종양 살해 효율을 드러냈습니다. 따라서 CQDs는 종양 세포와 조직에 대한 광감작제로 사용될 수 있습니다.

친환경 마이크로플라즈마 합성 황색 발광 탄소 양자점: 암세포 이미징 및 광촉매 불활성화 응용
세포내 ROS 생성. A HeLa 형광 이미지, (a) 밝은 필드 투과 이미지, (b) 400-450 nm 범위 CQDs 형광 이미지, (c) 510-530 nm 범위 ROS 검출 시약 형광 이미지, (d) 병합 이미지; B 다양한 농도 CQDs의 조사 유무에 따른 세포내 ROS 생성(15분); C 잠재적 형광 및 세포 사멸 에너지 전달 경로를 보여주는 단순화된 에너지 준위도. (S0, 형광체 분자 바닥 상태; S1, 제1 단일항 여기 상태; Sn(n>1); T1, 제1 삼중항 여기 상태; Ex, 광자 흡수에 의한 여기; FL, 형광)

또한, CQDs가 어떻게 종양을 정확히 표적화하고 종양 세포를 더 효과적으로 죽일 수 있을지는 여전히 미해결 문제입니다. 기존의 풍부한 표면 작용 친수성 기(카르복실, 카르보닐, 에폭시, 하이드록실 등)는 탄소 점이 특정 항체와 결합하여 종양을 정밀하게 표적화할 수 있게 하며, 이는 종양이 특정 바이오마커를 가져야 함을 요구합니다. 동시에 탄소 점은 높은 표면적 대 부피 비율로 인해 약물 및 유전자 전달 도구로도 사용될 수 있습니다[43]. 우수한 생체적합성, 종양 세포 내재화에 적합한 작은 크기, 풍부한 표면 작용기, 바이오이미징 잠재력을 고려할 때, 탄소 점(CQDs 포함)은 종양 치료를 위한 유망한 테라노스틱 후보가 될 것으로 믿어집니다. 그러나 나노의학과 바이오이미징에서 탄소 점 응용에는 여전히 과제와 미해결 문제가 많이 존재합니다. 향후 탄소 점 관련 나노의학의 벤치에서 베드사이드로의 전환을 촉진하기 위해 더 많은 노력이 필요합니다.

결론

요약하자면, 우리는 플라즈마 방법을 사용하여 o-페닐렌디아민으로 광발광 CQDs를 합성했습니다. 청색 레이저 여기 시 직경 약 3.2 nm의 CQDs가 황색 형광을 방출했습니다. 라만, UV-vis, FTIR, XPS 결과는 더 많은 탄소 원자가 sp² 혼성에 관여하여 새로운 유기 기를 형성함을 보여주었습니다. 플라즈마 방법으로 합성된 CQDs는 세포 이미징 실험에서 효과적인 프로브임이 입증되었으며, CQDs가 방출하는 황색 형광이 HeLa 세포를 명확히 표지할 수 있습니다. 또한 합성된 CQDs는 우수한 용해도, 무독성, 높은 생체적합성을 보여 바이오이미징 능력을 가속화할 수 있습니다. 게다가 흥분된 CQDs는 ROS 생성을 통해 HeLa 세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 이는 체외에서 CQDs의 만족스러운 광역학적 세포독성을 명확히 보여주며 PDT 응용을 뒷받침합니다.

실험 방법

탄소 양자점 합성

마이크로플라즈마 처리 시스템은 추가 파일 1: 그림 S1에 요약되어 있습니다. 내경 180 μm의 중공 스테인리스 파이프를 고전압 직류 전원(Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China)에 연결하고 용액 표면에서 2 mm 위에 유지했습니다. Pt 전극(DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China)을 전원 음극에 연결하고 용액에 담갔습니다. 그런 다음 400 mg o-페닐렌디아민(Shanghai, China)을 40 mL 탈염수에 녹이고, 20 mL o-페닐렌디아민 용액을 페트리 접시에 넣고 자기 교반기로 교반했습니다. 마이크로플라즈마 처리 중 아르곤(Ar) 기체가 60 sccm 유량으로 파이프를 통해 흐르고, DC 전류를 17 mA로 유지했습니다. 10분 플라즈마 처리 후, 갈색-검정 생성물을 투석막(분자량 컷오프, 500 Da)을 사용하여 2 L 탈염수에 대해 12시간 투석한 후 0.22 μm 초여과막으로 여과했습니다. 마지막으로 동결 건조로 순수 CQDs를 얻었습니다.

CQDs 구조, 조성, 광학적 특성 특성 분석

CQDs의 크기와 형태는 JEM-2100F 시스템(JEOL, Tokyo, Japan) TEM으로 특성화했습니다. 형광 분광법은 Perkin Elmer LS 55 발광 분광계(Waltham, MA, USA)로 수행했습니다. UV/Vis 흡수 스펙트라는 Varian Cary 50 UV-VIS 분광광도계(Palo Alto, CA, USA)로 측정했습니다. FTIR 스펙트라는 Nicolet 6700 분광기(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 얻었고, 라만 분광법은 800 UV 마이크로 라만 분광계(Invia-reflex, UK)로 수행했습니다. XPS 실험은 Axis Ultra DLD 시스템(Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japan)으로 수행했습니다.

세포 배양 및 세포독성 분석

HeLa 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 37°C, 가습 5% CO₂ 분위기에서 배양했습니다. CQDs 세포독성 연구를 위해 세포를 계수하여 6000 cells/well 밀도로 200 μL 완전 배지가 든 96웰 플레이트에 시딩했습니다. 24시간 배양 후, 세포를 0, 25, 50, 100, 200, 400 μg mL⁻¹ CQDs 농도로 추가 24시간 배양했고, MTT 분석으로 세포 생존율을 검출하여 CQDs 세포독성을 평가했습니다. 간단히, 이 용액들을 100 μL MTT 테스트 용액(0.5 mg mL⁻¹)으로 교체하고 암흑 조건에서 인큐베이터에서 4시간 배양했습니다. 상등액을 제거하고 결정체를 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 용해했습니다. 마지막으로 각 웰의 흡광도를 490 nm에서 측정했습니다. 광학 밀도는 CQDs 없는 대조 시료를 100% 생존율로 가정하여 세포 생존율과 연관시켰습니다.

MTT 분석은 또한 흥분된 CQDs의 HeLa 세포에 대한 IC50 평가에 사용되었습니다. 간단히, 96웰 플레이트 HeLa 세포를 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, 6400 μg mL⁻¹ CQDs 농도로 인큐베이터에서 24시간 배양하고, 460 nm 광으로 10분 또는 15분 별도 조사한 후 추가 24시간 배양했습니다. 각 웰의 세포 생존율을 MTT 분석으로 검출하고 데이터를 IC50 평가에 사용했습니다.

세포 이미징

2 × 10⁴ mL⁻¹ 농도 세포를 직경 15 mm 공초점 접시에 시딩하고 24시간 배양 후 PBS로 두 번 세척하여 죽은 세포가 없음을 확인했습니다. CQD 용액(200 μg mL⁻¹; pH 7)을 첨가하고 6시간 배양했습니다. 이후 PBS로 세 번 세척하여 비결합 CQDs를 제거하고 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 그런 다음 400-450 nm 파장 범위 여기로 CLSM(LSM510, Zeiss, Germany)으로 시료를 관찰했습니다.

광역학 치료 및 ROS 측정

항종양 효과를 조사하기 위해 HeLa 세포를 200 μg mL⁻¹ CQDs로 37°C 암흑 조건에서 24시간 배양하고 460 nm(30 mW cm⁻²) 광으로 5, 10, 15분 조사했습니다. 24시간 추가 배양 후 표준 MTT 분석으로 상대 세포 생존율을 결정했습니다. 세포내 ROS 생성은 Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit(sigma, USA)를 사용한 분광광도법으로 화학적으로 검출했습니다. 세포를 직경 15 mm 공초점 접시에 하룻밤 배양하여 세포 부착을 유도했습니다. 그런 다음 200 μg mL⁻¹ CQDs로 4시간 배양했습니다. 이후 100 μL/well 마스터 반응 혼합물을 첨가했습니다. 1시간 배양 후 4% 파라포름알데히드로 10분 고정하고, CLSM으로 세포 형광 이미지를 관찰했습니다. ROS 생성 검출을 위해, 200 μL 배양 배지가 든 96웰 플레이트에 세포를 배양했습니다. 24시간 배양 후 배지를 0, 100, 200 μg mL⁻¹ CQDs 용액 100 μL로 교체하고 추가 4시간 배양했습니다. 이후 PBS로 세 번 세척하고 15분 조사하거나 조사하지 않고, 100 μL/well 마스터 반응 혼합물로 1시간 배양했습니다. 마지막으로 형광 리더(520 nm 여기, 605 nm 방출)로 형광 강도를 검출했습니다.

통계 분석

본 연구 실험은 3회 반복 수행했으며, 통계 분석은 SPSS19.0으로 수행했습니다. 두 그룹 간 차이는 Mann-Whitney U 검정으로 비교했습니다. 흥분된 CQDs의 HeLa 세포에 대한 IC50은 비선형 회귀를 사용하여 평가했습니다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했습니다.

데이터 및 소재 가용성

현재 연구의 모든 데이터와 소재는 합리적 요청 시 교신 저자로부터 이용 가능합니다.

약어

PDT:
Photodynamic therapy
ROS:
Reactive oxygen species
CQDs:
Carbon quantum dots
TEM:
Transmission electron microscope
CLSM:
Confocal laser scanning microscope
DMEM:
Dulbecco's modified eagle medium
MTT:
3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
DMSO:
Dimethyl sulfoxide
IC50:
Half maximal inhibitory concentration

나노물질

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