환원제 및 캡핑제로 효모 추출물을 사용한 은 나노입자의 생합성 및 항균 활성

결과 및 토론

Ag 나노입자 합성

반응식 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, Ag 나노입자의 제조는 효모 추출물에서 생체 분자가 자가 조립되어 효모 미셀을 형성하는 것으로 시작되었다. 그런 다음 Ag ⁺ 아미노산, 비타민 및 탄수화물을 포함한 효모 추출물의 환원제에 의해 제자리에서 환원되었습니다. 형성된 Ag 나노입자는 생체분자에 의해 안정화되었다. Ag NPs의 표면 코팅은 세균막에 대한 친화력을 향상시켜 세포벽의 투과성을 증가시켰습니다. Ag 나노입자와 펩티도글리칸 사이의 상호작용은 펩티도글리칸의 배열을 변화시켰고, 결국 세포사멸 과정으로 이어져 박테리아를 손상시켰습니다.

Ag NP의 생합성에 대한 제안된 개략도

Ag 나노입자의 구조적 특성

도 1a에 도시된 바와 같이, 전형적인 SEM 이미지는 합성된 Ag 나노입자가 구형이고 미세한 크기를 가짐을 보여주었다. EDX는 Ag NP의 형성을 확인했다(그림 1b). 표면 플라즈몬 공명을 위한 은 나노결정의 전형적인 광흡수 피크인 약 3 keV에서 강한 광흡수 피크가 관찰되었다. 소량의 산소와 탄소는 합성된 Ag 나노입자의 얇은 유기 캡핑층에 기인할 수 있습니다. AgNO₃의 반응 NaOH 용액은 소량의 Ag₂를 형성합니다. O. 따라서 소량의 O도 Ag₂의 존재에 기인할 수 있습니다. O. Ag NPs의 형태와 크기는 고해상도 TEM(HRTEM)에 의해 추가로 특성화되었습니다. Ag NP의 직경은 10.3~18.9 nm(그림 1c)이며 평균 크기는 13.8 nm입니다(그림 1d). Ag NPs의 크기, 모양 및 표면 화학은 항균 활성에 중요한 영향을 보였다. 더 작은 크기와 더 높은 표면적은 Ag NP가 더 향상된 항균 활성을 위해 박테리아 막과 더 잘 상호작용할 수 있게 하였다[15,16,17]. HRTEM 이미지의 투명한 격자 무늬는 은의 (220) 평면에 해당하는 0.15 nm의 무늬 간격을 보여주었습니다(그림 2a). 도 2b에 도시된 바와 같이, Ag NPs의 결정질 특성은 전형적인 SAED(selected-area diffraction) 패턴에 의해 입증되었으며, 여기서 밝은 원형 고리는 (311), (220), (200) 및 ( 111) 비행기 [18, 19].

아 Ag NP의 전계 방출 SEM 이미지, b Ag NP의 EDX 스펙트럼, c Ag NP의 TEM 이미지 및 d Ag NP의 크기 분포

아 HR-TEM 이미지에서 Ag NP의 격자 무늬, b 전형적인 SAED(selected-area diffraction) 패턴의 Ag NP 원형 고리

Ag NP의 UV-Vis 스펙트럼은 표면 플라즈몬 공명으로 인한 418 nm에서 강한 피크를 나타냈습니다(그림 3a). 합성된 Ag NPs의 노란색 용액이 그림 3b에 나와 있으며, 이는 Ag NPs의 형성을 나타냅니다. 합성된 Ag 나노입자의 XRD 패턴 분석은 77.36°, 64.30°, 43.52°, 38.16°에서 4개의 강렬한 피크를 보여 은의 (311), (220), (200) 및 (111) 평면에 해당하며, 각각 (그림 3c). 데이터는 JCPDS 카드 번호 04-0783[20]의 표준 은 데이터로 확인되었습니다. XRD 패턴은 이전 보고서[21]와 일치하여 합성된 Ag 나노입자의 결정질 특성을 보여주었습니다. FTIR 분석은 합성된 Ag NP에서 잠재적인 생체 분자를 특성화하고 식별하는 데 사용되었습니다(그림 3d). 3405 cm ⁻¹ 의 광대역 −OH 스트레칭에 해당합니다[22]. 2915 cm ⁻¹ 에서 약한 피크 는 -CH2 신축 진동에 할당됩니다. 1655 cm ⁻¹ 의 밴드 효모 추출물에서 카르복실 부분의 C=O 신축 진동으로 인한 것이며, 이 밴드는 1573 cm ⁻¹ 로 이동합니다. Ag NP에서 카르복실 모이어티와 Ag NP 사이의 상호작용으로 인해 [23]. 1375 cm ⁻¹ 의 급격한 피크 CN 신축 진동에 기인합니다. 1048 cm ⁻¹ 의 밴드 및 1083 cm ⁻¹ C-O-C와 C-OH의 신축진동에 각각 할당된다[24, 25]. 이러한 결과는 효모 추출물의 생체 분자가 Ag 나노입자의 생합성에 책임이 있음을 보여주었다. Ag 나노입자의 표면 코팅은 세균막에 대한 친화력에 영향을 미쳤습니다[26, 27]. Ag NP의 상태는 XPS에 의해 추가로 특성화되었습니다. 그림 4a에서 볼 수 있듯이 명확한 피크가 있는 XPS 스펙트럼의 전체 스캔은 C 1s에 기인합니다. , Ag 3d , Ag 3p , Ag 3s 및 O 1s . Ag 3d (5/2) 및 Ag 3d (3/2) 피크는 각각 약 368.5 및 374.5 eV의 결합 에너지에서 관찰되었습니다(그림 4b). 6.0 eV의 에너지 분할 값은 Ag NP의 형성을 보여줍니다[28, 29].

아 Ag NP의 UV-Vis 스펙트럼, b 합성된 Ag NP의 사진, c Ag NP의 XRD 패턴 및 d Ag 나노입자 및 효모 추출물의 FTIR 스펙트럼

아 Ag NP 및 b의 XPS 스펙트럼 전체 스캔 Ag 3d XPS 스펙트럼

Ag NPs의 표면 전하는 Malvern Zeta Nano ZS-90 기기에 의해 결정되었으며, 이는 콜로이드 용액의 안정성과 분산의 중요한 매개변수입니다. 제타전위는 나노입자의 확산층과 치밀층 사이의 경계면에서의 표면 정전기 전위로 생체의학 고분자 응용의 지표가 된다[30]. 추가 파일 1:그림 S1에서 볼 수 있듯이 낮은 pH 값 3에서 Ag NP의 제타 전위는 약간 음전하(-3.2 mV)를 나타냅니다. Ag 나노입자의 제타 전위는 pH 7.0에서 -12.1 mV에서 pH 11.0에서 -24.4 mV로 단조 감소하여 Ag 나노입자 표면의 음전하 그룹을 확인했습니다. Gao et al. Ag NPs의 분산과 안정성은 주로 표면 전하에 기인한다고 보고했습니다[31]. 음으로 하전된 그룹의 존재는 수용액에서 Ag 나노입자의 안정성과 분산을 향상시킵니다[32].

Ag 나노입자의 세포독성 및 생체분자 분석

합성된 Ag 나노입자의 생체적합성은 추가적인 생물의학 응용에 중요합니다. Ag 나노입자의 세포독성을 조사하기 위해, Cos-7 세포의 세포 생존력을 MTS 분석으로 검출하였다. Cos-7 세포는 24시간 동안 다양한 농도의 Ag NP와 함께 배양되었습니다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 세포가 200 μg/mL의 높은 농도에서 Ag 나노입자로 처리되었을 때 유의한 세포독성이 나타나지 않았다. Ag NPs는 무시할만한 세포독성과 Cos-7 세포에 대한 우수한 생체적합성을 보였다고 결론지을 수 있습니다.

아 Cos-7 세포에서 Ag NP의 세포독성 및 b SDS-PAGE 분석. 레인 1:로딩 버퍼 제어. 레인 2-4:합성된 Ag NP. 레인 5:8000 rpm

합성된 Ag 나노입자의 합성 메커니즘을 탐색하기 위해 Ag 나노입자와 효모 추출물 표면의 생체 분자를 분석했습니다. 도 5b에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 분석은 합성된 Ag 나노입자의 표면 또는 효모 추출물에서 검출가능하거나 한계 단백질을 나타내지 않았다. 우리는 고속 아미노산 분석기로 효모 추출물의 생체 분자를 추가로 결정했습니다. 증빙 정보의 추가 파일 1:표 S1에 요약되어 있는 바와 같이 효모 추출물에는 글루탐산, γ-아미노부티르산, 장식물 및 알파-리놀렌산이 풍부한 약 22종의 아미노산이 있습니다. 이들 아미노산의 등전점은 약 6이지만 라이신과 아르기닌은 약 10~11이다. 또한 −NH₂를 포함하는 다양한 구성 요소 , 요소, 암모니아, 아스파라긴, 글루타민과 같은 물질이 발견될 수 있습니다. 효모 추출물의 환원성 아미노산, 알파-리놀렌산 및 탄수화물의 생체 분자는 Ag 나노입자 형성에 중요한 역할을 합니다. NADH 의존적 환원효소[33, 34] 또는 질산염 환원효소는 미생물 추출물을 통한 Ag 나노입자의 생합성에서 환원 과정[35,36,37]에 관여하는 것으로 보고되었다.

효모 추출물의 생체 분자는 Ag NP를 응집으로부터 보호하여 형성에 결정적인 역할을 합니다. 생체 분자의 안정제는 Ag 나노입자 사이의 중복 반응을 방지하는 데 도움이 됩니다[38]. 아미노산의 양쪽성 분자는 염기성 그룹과 산성 그룹을 모두 포함합니다. 이러한 아미노산 화합물의 순 전하는 효모 추출물 용액의 pH 변화에 따라 음수 또는 양수일 수 있으며, 이는 Ag 나노입자 합성 시 결합 능력에 더욱 영향을 미칩니다[39]. 알칼리 용액에서 Ag NP 표면의 아미노산은 정전기적 반발 상호작용을 최대화하는 순 음전하를 운반합니다[40,41,42]. 효모 추출물의 생체 분자는 캡핑제(capping agent) 역할을 하며 Ag NP 형성에서 크기 분포, 모양 및 형태를 제어하는 ​​데 중요한 역할을 합니다. pH 값은 연구에서 Ag NPs의 제어된 합성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. pH 값이 7 미만이면 핵 생성이 낮은 속도로 발생합니다. Ag NP는 더 높은 pH 값에서 몇 분 안에 형성될 수 있으며 입자 크기는 용액의 pH 값이 증가함에 따라 감소합니다. 성장 과정과 핵 생성 사이에 최적의 균형이 입증되었습니다[43]. 불안정하고 덩어리진 Ag NPs는 항상 극단적인 pH 값(> 11)을 갖는 용액의 환원 과정에서 나타납니다[44].

항균 활동

이. 대장균 Ag NPs의 항균 활성에 대해 광범위하게 평가되었습니다. 의 성장 E. 대장균 Ag NP의 존재 여부는 항균 능력을 입증합니다. 도 6a에 도시된 바와 같이 합성된 Ag 나노입자는 E에 대해 농도 의존적으로 유의한 항균 활성을 나타내었다. 대장균 . 성장 억제 분석은 E의 완전한 감소를 입증했습니다. 대장균 음성 대조군과 비교하여 20.0 μg/mL 이상의 Ag NP 농도에서. 반 억제 농도(EC₅₀ )의 Ag NPs는 13.4 μg/mL였다. 20.0 μg/mL Ag 나노입자의 투여량은 E에 대해 상당한 항균 효과를 나타냈다. 대장균 테스트 시간 내내 10.0 μg/mL Ag 나노입자는 부분적인 억제 효과를 나타냈습니다(그림 6b).

아 E의 성장 억제. 대장균 그리고 b 항균 효과의 시간 경과 분석

Ag 나노입자가 실제로 항생제 내성 세균 세포에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 우리는 암피실린 내성 E에 대한 Ag 나노입자의 항균 활성을 평가했습니다. 대장균 집락 형성 단위 분석에 의해. 이. 대장균 -앰프 ⁺ E에 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자를 포함하는 pcDNA3.4 플라스미드의 높은 카피 수를 안정적으로 발현합니다. 대장균 [45]. E. 대장균 -앰프 ⁺ 세포는 ampicillin 단독 처리 또는 Ag NPs와의 조합 처리에서 LB 한천 플레이트에서 성장했습니다. 제조된 Ag 나노입자의 억제 활성을 Fig. 7에 나타내었다. Ampicillin과 병용 처리한 Ag 나노입자는 ampicillin 단독 투여에 비해 우수한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다. 대조적으로, 암피실린 단독 치료는 E에 대한 억제 활성이 없습니다. 대장균 -앰프 ⁺ . 항생제와 Ag 나노입자의 병용 요법은 항생제 내성 박테리아 세포를 극복하기 위한 보완 전략을 제공하여 현재의 치료 접근법을 더욱 향상시킵니다. 이 연구에서 제시된 전반적인 결과는 다제내성 세균 균주에 의해 유발되는 세균 감염을 치료하기 위한 대체 항균 억제제의 개발에 기여합니다.

의 성장 E. 대장균 -앰프 ⁺ 암피실린 단독(50 μg/mL) 또는 Ag 나노입자(25 μg/mL)와 함께 치료. 아 고밀도 및 b 저밀도 E. 대장균 -앰프 ⁺ 세포

박테리아 내성을 퇴치하기 위해 다양한 기전을 가진 새로운 약물이 크게 필요합니다. 강력한 항균 활성으로 인해 Ag NP는 의료 제품, 개인 위생 용품 및 직물에 사용되었습니다. Ag NP가 미생물 내성과 싸우는 여러 메커니즘이 있습니다[46]. Ag NP는 세균막 표면에 축적되어 세포벽의 투과성을 증가시킵니다. Ag 나노입자와 펩티도글리칸 사이의 상호작용은 펩티도글리칸의 배열을 변화시켜 세균막을 손상시켰다[47]. Ag NPs의 모양, 표면 구조, 형태, 분산성 및 생체 적합성의 특성은 항균 활성에 중요한 역할을 합니다.