효모 추출물로 은 나노입자 녹색 합성: 제어된 형태와 향상된 항균 활성

요약

세포독성 환원제와 계면활성제 없이 항균 은 나노입자(Ag NPs)를 제조하는 생물학적 합성은 친환경적 방법입니다. 본 연구에서는 효모 추출물을 환원제와 캡핑제로 사용하여 형태 제어되고 잘 분산된 Ag NPs를 생물학적으로 합성했습니다. 합성된 Ag NPs는 균일한 구형과 미세한 크기를 보이며 평균 크기 13.8 nm입니다. 효모 추출물 내 환원성 아미노산, α-리놀렌산, 탄수화물 생체분자가 Ag NPs 형성에 중요한 역할을 함을 푸리에 변환 적외선 분광법 분석으로 입증했습니다. 또한 Ag NPs 표면 아미노산이 알칼리 용액에서 순음전하를 띠어 정전기적 반발 상호작용을 최대화하여 침전 없이 1년 이상 우수한 안정성을 제공합니다. Ag NPs와 암피실린 병용 처리가 암피실린 내성 E. coli 세포에서 내성을 역전시켰습니다. 이러한 단분산 Ag NPs는 다약제 내성 세균 균주 소독을 위한 유망한 대안이 될 수 있으며, Cos-7 세포에 대해 무시할 만한 세포독성과 좋은 생체적합성을 보였습니다.

서론

약물 내성 감염은 주요 사망 원인이며 공중 보건에 심각한 위험을 초래합니다. 또한 항생제 내성 증가는 의학에서 긴급한 문제로 부상하고 있습니다. 수많은 Staphylococcus aureus 균주가 메티실린 내성을 가지며 병원 감염 주요 원인입니다. 또한 페니실린 내성 Neisseria gonorrhoeae와 다약제 내성 Escherichia coli(E. coli) 등 다른 항생제 내성 세균도 존재합니다. 주요 내성 기전은 항생제 유출 증가와 흡수 감소입니다. 또 다른 약물 내성 기전은 항생제 분자 구조를 변형시키는 효소 발현입니다. 차세대 항균제 개발에 많은 노력이 집중되었으나 우수한 소독법에 대한 수요 증가하고 있습니다.

은 나노입자(Ag NPs)는 단백질 운반체, 방사선 감응제, 태양 연료 전지 효율 향상, 항균제 등 많은 응용에 사용됩니다. 나노입자 중 금속 함유 나노입자, 특히 Ag NPs가 항균제로 가장 널리 사용됩니다. 실제로 은 나노입자는 세균 균주에 유의미한 항균 활성 보이지만 동물 세포에 무시할 만한 세포독성 나타냅니다. 게다가 Ag NPs는 곰팡이, 특정 바이러스, 항생제 내성 세균 균주에도 항균 활성 보입니다. 작용 기전으로 DNA 복제 억제, 세포질막 필요 전기적 전위차 차단, 호흡 사슬 억제 등이 Ag NPs 주요 작용 기전입니다. 따라서 Ag NPs 크기, 표면 구조, 제어된 형태가 항균 활성과 기타 응용에 결정적 역할 합니다. Ag NPs 제조 일반적 방법은 적절한 계면활성제 존재 하 은 이온 환원으로 Ag NPs 제어 성장 달성하는 것입니다. 대부분의 환원제와 계면활성제는 인체 조직 세포에 세포독성 보이고 잠재적 환경 오염 유발. 따라서 형태 제어 Ag NPs 제조 위한 친환경 방법 개발 필수적입니다.

본 연구에서는 효모 추출물 이용 Ag NPs 생물학적 합성 새로운 경로 제시합니다. 공정 중 효모 추출물은 아미노산, 비타민, 탄수화물 등 환원제와 캡핑제 공급하며 은 이온은 전자 수용체 역할. 그 결과 유기 캡핑제가 표면 제공하는 우수한 안정성으로 단분산 Ag NPs가 침전 없이 1년 이상 보존 가능. Ag NPs가 암피실린 내성 E. coli 세포에 대해 암피실린 대비 우수한 항균 활성 나타냄 확인. 기존 합성법 대비 본 생물학적 합성법은 생체적합성, 비용 효율성, 환경 친화성 우수. 또한 형태 제어되고 잘 분산된 Ag NPs가 E. coli에 좋은 항균 효과 보임.

실험 방법

재료

질산은(AgNO₃), 수크로스(C₁₂H₂₂O₁₁), 염화나트륨(NaCl), 수산화나트륨(NaOH) Sinopharm Co., Ltd. 구매. 건조 베이커 효모 AB/MAURI Co., Ltd. 구매. E. coli TransGen Biotech Co., Ltd. 구매. CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 키트(MTS) Promega Biotech Co., Ltd. 구매. pcDNA3.4 플라스미드, 1×NuPAGE® LDS 샘플 버퍼, Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) Thermo Fisher Scientific Inc. 구매. 암피실린, Luria-Bertani(LB) 배지 Sangon Biotech Co., Ltd. 구매. 모든 시약 분석급 사용, 추가 정제 없이 사용. 실험 전반에 탈ion 초순수(18.2 MΩ·cm) 사용.

Ag NPs 합성

비축 효모 세포를 LB 배지에 접종하여 25 °C에서 약 150 rpm 교반하며 하룻밤 활성화. 활성화된 효모 세포를 0.9% 생리식염수로 세척 후 2% 수크로스 용액에 분산시켜 25 °C에서 약 150 rpm 교반 6시간. 최종적으로 2000 rpm 5분 원심분리로 무세포 효모 추출물 수집하여 Ag NPs 생물학적 합성 사용. 생물학적 합성 공정 중 효모 추출물 pH를 NaOH 용액으로 10 조절 후 AgNO₃ 용액을 격렬 자기 교반 하 점진적 첨가. 최종 얻어진 Ag NPs 1 kDa 투석막으로 5일 투석 후 동결건조하여 추가 특성화용.

특성 분석

Ag NPs 투과전자현미경(TEM) 이미지 JEM-2100 현미경(가속 전압 200 kV, JEOL, 일본) 관찰. 주사전자현미경(SEM) 이미지 에너지 분산 분광기(EDS) 장착 Carl Zeiss ULTRA plus SEM(Carl Zeiss, 독일, 20 kV 작동) 획득. 자외선-가시광(UV-Vis) 흡수 스펙트럼 Lambda 950 UV/Vis/NIR 분광광도계(Perkin-Elmer, 미국) 기록. X선 분말 회절(XRD) 패턴 D8 Advance 기기(Bruker, 독일) 획득. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 4000-500 cm⁻¹ 범위 KBr 펠릿 시료로 Vertex 70 FTIR 분광기(Bruker, 독일) 기록. Ag NPs 제타 전위 Malvern Zeta Nano ZS-90(Malvern, 영국) 25 °C 측정. Ag NPs 표면 원소 X선 광전자 분광법(XPS) 단색 Al Kα 소스(1486.6 eV) Kratos AXIS Ultra DLD 기기(Shimadzu, 일본) 확인. 아미노산 성분 L-8900 고속 아미노산 분석기(Hitachi, 일본) 분석.

세포 독성 분석

제조된 Ag NPs 생체적합성 탐구 위해 MTS assay로 Ag NPs 세포독성 평가. Cos-7 세포 5% CO₂, 37 °C 가습 분위기 인큐베이터에서 10% FBS 완전 배지 보충 DMEM 배양. 세포 96웰 평바닥 플레이트 웰당 10000개 밀도 플레이팅 후 24시간 배양. 이후 신선 DMEM 배지에 다양한 농도 Ag NPs 함유하여 배양액 교체. 추가 24시간 인큐베이션 후 MTS로 상대적 생존 세포 결정. 흡광도 490 nm SpectraMax® M5 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, 미국) 측정. DMEM 배지 무처리 세포 대조군 사용.

SDS-PAGE 분석

표준 SDS-PAGE 10%(w/v) 분리 겔, 4% 적층 겔 수행. 시료 1×NuPAGE® LDS 샘플 버퍼와 5분 끓인 후 12000 rpm 5분 원심분리 후 겔 적용. 표준 단백질 마커 참조 대조군 사용. 겔 0.5% 쿠마시 블루 염색. 겔 이미지 GelDoc XR⁺ 젤 이미징 시스템(Bio-Rad, 미국) 기록.

항균 활성 연구

항균 활성 결정 위해 합성 Ag NPs 대 E. coli 살균 활성 테스트. 단일 E. coli 콜로니 37 °C LB 배지 150 rpm 오비탈 셰이커 하룻밤 배양. 콜로니 신선 LB 배지로 OD 0.01-0.02(600 nm) 조절. 96웰 마이크로플레이트 웰당 Ag NPs 연속 희석 100 μL 분주. 희석 E. coli 용액 100 μL 접종 후 37 °C 16시간 인큐베이션. E. coli 생존율 SpectraMax® M5 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, 미국) 600 nm 흡광도 측정 결정. 시간 경과 분석으로 E. coli 항균 감수성 시간 경과 평가. 최종 10, 20 μg/mL Ag NPs 함유 멸균 튜브에 E. coli 용액 100 μL 첨가. 1, 2, 4, 6시간 후 SpectraMax® M5로 600 nm 흡광도 측정.

콜로니 형성 단위 assay로 항생제 내성 세균 세포 대상 Ag NPs 조사. E. coli β-락타마제 유전자 함유 pcDNA3.4 플라스미드 안정 발현하여 암피실린 내성 모델로 사용. 암피실린 내성 E. coli(E. coli-Amp⁺) 세포 대수기 도달 시 LB 한천 배지에서 암피실린 단독 처리 또는 Ag NPs 병용 처리 후 37 °C 18시간 인큐베이션. LB 플레이트 형성 E. coli-Amp⁺ 콜로니 수 계산. 모든 assay 최소 3회 반복 수행.

결과 및 논의

Ag NPs 합성

Scheme 1 모식도처럼 Ag NPs 제조는 효모 추출물 생체분자 자기조립으로 효모 미셀 형성으로 시작. 효모 추출물 내 환원제(아미노산, 비타민, 탄수화물)에 의해 Ag⁺ 현장 환원. 형성된 Ag 나노입자 생체분자로 안정화. Ag NPs 표면 코팅 세균막 친화성 높여 세포벽 투과성 증가. Ag NPs와 펩티도글리칸 상호작용 펩티도글리칸 구성 변화시켜 최종 아포토시스 과정 유도해 세균 손상.

Ag NPs 생물학적 합성 제안 모식도

Ag NPs 구조적 특성화

그림 1a 전형적 SEM 이미지에서 합성 Ag NPs 구형 미세 크기 확인. EDX로 Ag NPs 형성 확인(그림 1b). 약 3 keV 강한 광흡수 피크 관찰, 표면 플라즈몬 공명 위한 은 나노결정 전형적 흡수 피크. 소량 산소, 탄소는 합성 Ag NPs 얇은 유기 캡핑층 기인. AgNO₃ 용액 NaOH 반응 소량 Ag₂O 형성. 따라서 소량 O는 Ag₂O 존재에도 기인 가능. Ag NPs 형태와 크기 고분해능 TEM(HRTEM) 추가 특성화. Ag NPs 직경 10.3-18.9 nm 범위(그림 1c), 평균 13.8 nm(그림 1d). Ag NPs 크기, 형태, 표면 화학이 항균 활성 중요 영향. 더 작은 크기 높은 비표면적 세균막과 더 나은 상호작용으로 항균 활성 추가 향상. HRTEM 이미지 선명한 격자 무늬 0.15 nm 간격(그림 2a) 은 (220) 면 대응. 그림 2b 전형적 선택영역 전자회절(SAED) 패턴 밝은 원형 링 (311), (220), (200), (111) 면 대응으로 Ag NPs 결정성 입증.

a Ag NPs 전계방출 SEM 이미지, b Ag NPs EDX 스펙트럼, c Ag NPs TEM 이미지, d Ag NPs 크기 분포

a HR-TEM 이미지 Ag NPs 격자 무늬, b 전형적 SAED 패턴 Ag NPs 원형 링

Ag NPs UV-Vis 스펙트럼 표면 플라즈몬 공명 기인 약 418 nm 강한 피크 나타남(그림 3a). 합성 Ag NPs 노란 용액 사진(그림 3b) Ag NPs 형성 지시. 합성 Ag NPs XRD 패턴 분석 77.36°, 64.30°, 43.52°, 38.16° 네 강한 피크 은 (311), (220), (200), (111) 면 대응(그림 3c). 데이터 JCPDS card No. 04-0783 표준 은 데이터 확인. XRD 패턴 합성 Ag NPs 결정성 입증, 이전 보고서 일치. FTIR 분석 합성 Ag NPs 잠재 생체분자 특성화 확인 수행(그림 3d). 3405 cm⁻¹ 넓은 밴드 -OH 신축 대응. 2915 cm⁻¹ 약한 피크 -CH₂ 신축 진동 할당. 효모 추출물 1655 cm⁻¹ 밴드 카복실기 C=O 신축 진동 기인, Ag NPs에서 1573 cm⁻¹로 시프트되어 카복실기와 Ag NPs 상호작용 때문. 1375 cm⁻¹ 날카로운 피크 C-N 신축 진동 기인. 1048 cm⁻¹, 1083 cm⁻¹ 밴드 각각 C-O-C, C-OH 신축 진동 할당. 이 결과들 효모 추출물 생체분자 Ag NPs 생물학적 합성 책임 입증. Ag NPs 표면 코팅 세균막 친화성 영향. Ag NPs 상태 XPS 추가 특성화. 그림 4a XPS 전체 스캔 스펙트럼 C 1s, Ag 3d, Ag 3p, Ag 3s, O 1s 명확한 피크 귀속. Ag 3d(5/2), Ag 3d(3/2) 피크 각각 약 368.5, 374.5 eV 결합 에너지 관찰(그림 4b). 6.0 eV 에너지 분할 값 Ag NPs 형성 입증.

a Ag NPs UV-Vis 스펙트럼, b 합성 Ag NPs 사진, c Ag NPs XRD 패턴, d Ag NPs 및 효모 추출물 FTIR 스펙트럼

a Ag NPs XPS 전체 스캔 스펙트럼, b Ag 3d XPS 스펙트럼

Ag NPs 표면 전하 Malvern Zeta Nano ZS-90 기기 측정, 콜로이드 용액 안정성, 분산성 중요 파라미터. 제타 전위는 나노입자 확산층과 밀착층 경계 표면 정전기적 전위, 생물의학 고분자 응용 지표. 부록 Figure S1에서 pH 3 저pH 제타 전위 약음전하(-3.2 mV) 나타남. Ag NPs 제타 전위 pH 7.0 -12.1 mV에서 pH 11.0 -24.4 mV로 단조 감소하여 Ag NPs 표면 음전하 기 존재 확인. Gao 등 Ag NPs 분산 안정성 주로 표면 전하 기인 보고. 음전하 기 존재 수용액 Ag NPs 안정성, 분산성 향상.

Ag NPs 세포독성 및 생체분자 분석

합성 Ag NPs 생체적합성 추가 생물의학 응용 중요. Ag NPs 세포독성 조사 위해 MTS assay로 Cos-7 세포 생존율 검출. Cos-7 세포 다양한 농도 Ag NPs 24시간 인큐베이션. 그림 5a에서 200 μg/mL 고농도 Ag NPs 처리 시에도 유의미한 세포독성 나타나지 않음. Ag NPs Cos-7 세포 تجاه 무시할 만한 세포독성, 좋은 생체적합성 결론.

a Cos-7 세포 Ag NPs 세포독성, b SDS-PAGE 분석. 레인 1: 로딩 버퍼 대조. 레인 2-4: 합성 Ag NPs. 레인 5: 8000 rpm 원심분리 효모 추출물

합성 Ag NPs 합성 메커니즘 탐구 위해 Ag NPs 표면 생체분자와 효모 추출물 분석. 그림 5b SDS-PAGE 분석 합성 Ag NPs 표면 또는 효모 추출물 검출 가능 또는 미미 단백질 없음 확인. 고속 아미노산 분석기로 효모 추출물 생체분자 추가 결정. 부록 Table S1 요약처럼 효모 추출물 약 22종 아미노산 풍부, 특히 글루탐산, γ-아미노부티르산, 오르니틴, α-리놀렌산 풍부. 이 아미노산 등전점 약 6, 라이신, 아르기닌 제외 약 10-11. 또한 -NH₂ 함유 요소, 암모니아, 아스파라긴, 글루타민 등 다양한 성분 발견. 효모 추출물 환원성 아미노산, α-리놀렌산, 탄수화물 생체분자 Ag NPs 형성 중요한 역할. 미생물 추출물 경로 Ag NPs 생물학적 합성에서 NADH 의존적 환원효소 또는 질산염 환원효소 관여 보고됨.

효모 추출물 생체분자 Ag NPs 형성 결정적 역할: 응집 방지 보호. 생체분자 안정제 Ag NPs 간 중복 반응 방지. 아미노산 양쪽성 분자 염기성, 산성 기 모두 포함. 이 아미노산 화합물 순전하 효모 추출물 용액 pH 변화 따라 음성 또는 양성 될 수 있어 Ag NPs 합성 중 결합 능력 추가 영향. 알칼리 용액에서 Ag NPs 표면 아미노산 순음전하 띠어 정전기적 반발 상호작용 최대화. 효모 추출물 생체분자 캡핑제 역할 Ag NPs 형성 크기 분포, 형태, 형상 제어 핵심 역할. pH 값 본 연구 Ag NPs 제어 합성 영향 중요 인자. pH 7 미만 핵생성 저속 발생. 높은 pH 값에서 Ag NPs 몇 분 내 형성, 입자 크기 용액 pH 증가 따라 감소. 핵생성 성장 공정 간 최적 균형 입증. 극단 pH 값(>11) 환원 공정 용액 불안정 응집 Ag NPs 항상 존재.

항균 활성

E. coli Ag NPs 항균 활성 광범위 평가. Ag NPs 유무 E. coli 성장 항균 능력 입증. 그림 6a 합성 Ag NPs 농도 의존적 E. coli 유의미 항균 활성 나타냄. 성장 저해 assay 20.0 μg/mL 이상 Ag NPs 농도 음성 대조 대비 E. coli 완전 저해 입증. Ag NPs 반수 저해 농도(EC₅₀) 13.4 μg/mL. 20.0 μg/mL Ag NPs 테스트 시간 전체 유의미 항균 효과, 10.0 μg/mL 부분적 저해 효과(그림 6b).

a E. coli 성장 저해, b 항균 효과 시간 경과 분석

Ag NPs 항생제 내성 세균 세포 실제 영향 조사 위해 콜로니 형성 단위 assay로 암피실린 내성 E. coli 대상 Ag NPs 항균 활성 평가. E. coli-Amp⁺ β-락타마제 유전자 함유 고카피수 pcDNA3.4 플라스미드 안정 발현으로 E. coli 암피실린 내성 부여. E. coli-Amp⁺ 세포 LB 한천 배지 암피실린 단독 처리 또는 Ag NPs 병용 처리 후 37 °C 18시간 인큐베이션. 제조 Ag NPs 저해 활성 그림 7 제시. Ag NPs 암피실린 병용 처리가 암피실린 단독 대비 우수 항균 활성 나타냄 주목. 반면 암피실린 단독 처리 E. coli-Amp⁺ 저해 활성 없음. 항생제-Ag NPs 병용 요법 항생제 내성 세균 세포 극복 상보적 전략 제공, 현재 치료 접근법 추가 개선. 본 연구 전체 결과 다약제 내성 세균 균주 유발 세균 감염 치료 대체 항균 저해제 개발 기여.

암피실린 단독(50 μg/mL) 처리 또는 Ag NPs(25 μg/mL) 병용 처리 E. coli-Amp⁺ 성장. a 고밀도, b 저밀도 E. coli-Amp⁺ 세포

세균 내성 퇴치 다른 기전 신약 절실. 강력한 항균 활성으로 Ag NPs 의료 제품, 퍼스널 케어 제품, 섬유 사용. Ag NPs 미생물 내성 퇴치 다중 기전 존재. Ag NPs 세균막 표면 축적 세포벽 투과성 증가. Ag NPs 펩티도글리칸 상호작용 펩티도글리칸 구성 변화시켜 세균막 손상. Ag NPs 특성 형태, 표면 구조, 형상, 분산성, 생체적합성 항균 활성 중요한 역할.

결론

본 연구에서는 효모 추출물 이용 Ag NPs 제조 새로운 생물학적 합성법 보고. Ag⁺ 용액 효모 추출물 혼합 시 효모 미셀 형성. 생물학적 환원 생체분자 Ag⁺ 환원 주요 역할. 또한 생체분자 우수한 안정성, 단분산성, 제어된 크기 분포 제공하여 합성 Ag NPs 침전 없이 1년 이상 좋은 안정성 나타냄. 고속 아미노산 분석 효모 추출물 아미노산, α-리놀렌산, 아미노부티르산 등 생체분자 풍부함 드러냄. Ag NPs 농도 의존적 E. coli 유의미 항균 활성. 성장 저해 assay 20.0 μg/mL 이상 Ag NPs 농도 E. coli 완전 저해 입증. Ag NPs 암피실린 병용 처리 암피실린 단독 대비 암피실린 내성 E. coli(E. coli-Amp⁺) 세포 우수 항균 활성. Ag NPs 표면 코팅 세균막 친화성 높여 세포벽 투과성 증가. Ag NPs 펩티도글리칸 상호작용 펩티도글리칸 구성 변화시켜 최종 세균 아포토시스 유도. 또한 생체분자 안정화 Ag NPs 낮은 세포독성, Cos-7 세포 좋은 생체적합성 나타냄.