탄소 양자점/산화아연 나노복합체를 통한 종양 표지자 사이토케라틴-19 단편(CYFRA 21-1)의 새로운 면역 감지-형광 검출

결과 및 토론

탄소 양자점 및 그 나노복합체의 형태학적 평가

투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 샘플에서 표면 형태와 CQD의 분포를 특성화했습니다. TEM에서 시험을 수행하기 위해 준비된 CQD 현탁액 약 4 μL를 TEM의 탄소 그리드 표면에 떨어뜨렸습니다. HRTEM 이미지(그림 1a)에서 관찰된 격자 간격(0.36 nm)이 있는 균일한 검은색 반점은 CQD의 형성을 나타냅니다. 입자 크기 분포 그래프가 그려졌고 평균 입자 크기는 1.5 ± 0.5에서 5.0 ± 0.5 nm 범위였습니다(그림 1b). 얻어진 입자 크기는 형성된 CQD가 실제로 양자 크기의 나노 물질임을 입증했습니다. 또한, 동적 광산란(DLS)을 수행한 결과 평균 입자 크기는 ~ 20 ± 0.2 nm인 것으로 나타났습니다. 이전 두 측정 간의 차이가 관찰되었습니다. 이전 연구에서는 HRTEM이 비정질 특성으로 인해 더 높은 배율에서 형성된 CQD의 결정 격자 구조를 나타내지 않는 것으로 나타났습니다[43]. 마찬가지로, 이 연구에서 탄소의 천연 전구체는 감귤류 레몬입니다. 과피 및 파생된 CQD도 무정형 특성을 나타냈다. 따라서 입자 크기 측정의 차이는 형성된 CQD의 덩어리, 형성된 탄소 점의 무정형 특성, 각 실험과 관련된 메커니즘 및 입자의 수화 역학에 기인할 수 있습니다.

아 직경이 5 nm이고 b인 CQD의 고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM) 이미지 TEM 기반 CQD의 크기 분포 그래프

제조된 CQDs/ZnO 나노복합체를 TEM과 SEM을 이용하여 조사하였다. TEM 이미지(그림 2a)에서 CQD에 부착된 육각형 입자의 존재는 CQD/ZnO 나노복합체의 형성을 나타냅니다. SEM에서 나노복합체 샘플은 샘플에 의한 전자 흡수와 전하 축적을 방지하기 위해 금으로 코팅되었습니다. 적용된 가속 전압은 배율 × 30,000에서 15 kV였습니다(그림 2b).

아 그리고 b CQDs/ZnO 나노복합체의 투과전자현미경 및 주사전자현미경 이미지를 나타냅니다.

CQD의 UV-Vis 및 형광 스펙트럼이 연구되었으며 기록된 스펙트럼은 p ~p* 그리고 n ~피* 각각 C=C 및 C=O의 전환. 또한, CQD의 형광 스펙트럼은 최대 λ_ex에서 두 개의 신호를 표시했습니다. =360 및 λ_em =453 nm(그림 3a, b). 또한 CQDs/ZnO 나노복합체의 UV-Vis 스펙트럼을 연구했습니다. 370 nm에서 상당한 흡수 피크가 관찰되어 청록색 이동을 표시했습니다(그림 4a). CQDs/ZnO 나노복합체의 광발광(PL) 특성을 연구했습니다. CQD의 크기와 표면 결함은 발광 특성에 큰 영향을 미칩니다. 여기 파장의 함수로 CQD의 (PL) 방출이 다양했습니다[38]. 또한, ZnO 나노 크기 입자는 청색에서 녹색으로의 흡수 가시 영역에서 결함 관련 방출을 나타냈다[41]. 따라서 CQD로 장식된 ZnONP는 PL 방출을 위한 우수한 나노복합체를 생산했습니다. 그림 4b에서 볼 수 있듯이 CQDs/ZnO의 PL 스펙트럼은 여기 파장 470 nm 후 520 nm에서 상당한 피크와 함께 청색 편이를 나타냅니다. 관찰된 이동은 CQD와 ZnONP의 에너지 밴드 사이의 중첩에 기인할 수 있습니다. 표시된 청색 편이는 결함 방출 레벨 2.1 eV에서 발생했습니다.

CQD의 분광 스펙트럼(a ) 224 및 280 nm에서 UV-Vis 스펙트럼 및 (b ) λ_ex에서 CQD의 형광 스펙트럼 =360 및 λ_em =452 nm

CQD/ZnONP의 분광 스펙트럼 a 370 nm 및 b 흡수 피크에서의 UV-Vis 스펙트럼 λ_ex에서 CQD/ZnONP의 광발광 스펙트럼 =470 및 λ_em =520 nm

비접합 모노클로날 BM 19.21 항체로 CQDs/ZnO 나노복합체 및 고정화된 CQDs/ZnO 나노복합체의 형성을 확인하기 위해 비교 FT-IR 연구를 수행했습니다. 기록된 CQD의 FT-IR 스펙트럼은 3462 cm ⁻¹ 에서 진동 피크를 늘리는 것을 포함하여 특정 기능기에 해당하는 서로 다른 고유한 피크의 존재를 나타냅니다. 및 2932 cm ⁻¹ C–OH 및 C–H 그룹에 대해 각각. 또한 1749 cm ^-1 에서 3개의 진동 흡수 밴드가 관찰되었습니다. , 1375 cm ⁻¹ 및 1246 cm ⁻¹ 각각 C=O, C–N 및 C–O–C 작용기의 존재에 해당합니다(그림 5a). 436 cm ⁻¹ 의 새로운 피크 Zn-O의 신축 진동대에 해당하는 것으로 관찰되었다. CQD의 환원 및 안정화 특성은 표면에 -OH 및 COOH 그룹의 존재로 인해 얻어졌습니다. 이러한 작용기는 전자 공여체 역할을 하며 CQD/ZnO 나노복합체 형성에 강한 친화력을 가지고 있습니다. 따라서 CQD는 형성된 나노복합체를 감소시키고 안정화시켰다(그림 5b). 그림 5c와 같이 3254 cm ^-1 에서 두 개의 새로운 피크가 형성되었음을 알 수 있습니다. 및 1675 cm ⁻¹ . 이러한 피크는 각각 NH 및 C=O의 신축 진동과 펩타이드 결합을 통한 CQDs/ZnO-BM 19.21의 고정화에 기인합니다.

a의 FT-IR 스펙트럼 CQD, b CQD/ZnO 나노복합체 및 c 고정된 CQD/ZnO-BM 19.21 나노복합체

녹색 합성 CQD의 X선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼을 조사했습니다. 얻은 CQD 스펙트럼(그림 6a)은 C=O 및 COOH에 대해 각각 288 및 286 eV에서 서로 다른 작용기를 나타냅니다. 또한, Zn 2p_1/2의 경우 1044.4 및 1021.5 eV에서 두 개의 중요한 결합 에너지 피크가 관찰되었습니다. 및 Zn 2p_3/2 , 각각(그림 6b). 또한, CQDs/ZnO 나노복합체의 고해상도 XPS 스펙트럼은 O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p 및 Zn 3d에 대해 560, 385, 350, 246 및 200 eV에서 서로 다른 결합 에너지 피크의 존재를 확인했습니다. 각각(그림 6c). 앞서 언급한 모든 데이터는 CQD/ZnO 나노복합체를 형성하는 CQD 표면에 ZnO의 존재를 입증했습니다.

a의 X선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼 CQD, b ZnO 및 c CQD/ZnO 나노복합체

CQD와 CQD/ZnO 나노복합체의 XRD 패턴 간의 비교 연구가 수행되었다. 탄소 점에 대한 20°(2Ɵ)에서 넓은 피크가 CQD의 XRD 패턴에서 관찰되었습니다(그림 7a). 그러나 Zn(100)의 경우 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° 및 80°(2Ɵ)에서 서로 다른 날카로운 피크가 인식되었으며, (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004), (202) 각각. 관찰된 피크는 CQD/ZnO 나노복합체를 형성하는 CQD 표면의 ZnO 분포를 반영합니다(그림 7b).

a의 X선 회절 패턴 CQD 및 b CQD/ZnO 나노복합체

준비된 CQDs, CQDs/ZnO 및 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 라만 스펙트럼을 연구했습니다. 라만 신호는 일반적으로 결정 구조와 그 결함을 연구하는 데 사용됩니다. 그림 8a는 1300 및 1520 cm ⁻¹ 에서 두 개의 일반적인 D 및 G 밴드를 보여줍니다. 탄소 나노 입자에 대해 각각. 이전에 보고된 바와 같이 D-밴드는 일반적으로 sp ³ 을 나타냅니다. 결함 및 G-밴드는 sp ² 평면 진동의 특징입니다. -결합 탄소 [44]. 나 _디 /나 _G 준비된 CQD에 대해 비율을 계산한 결과 1.02 ± 0.03으로 나타났다. 440 및 520 cm ⁻¹ 에서 새로운 날카로운 피크가 관찰되었습니다. ZnO 나노입자 및 CQD의 전형적인 피크는 1364 및 1595 cm ^-1 에서 관찰되었습니다. . 나의 비율 _디 /나 _G CQDs/ZnO 나노복합체의 형성을 나타내는 1.2 ± 0.01로 밝혀졌다(그림 8b). 고정된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 라만 스펙트럼은 2차 및 3차 구조의 확인 징후로 쉽게 인식될 수 있는 수많은 피크를 표시했습니다. 1007–1128 cm ⁻¹ 영역에서 관찰된 피크 단일 클론 항체의 주요 2차 구조를 나타내도록 지정되었습니다. 라만 피크는 550–682 cm ⁻¹ 입니다. 영역은 이황화 형태를 나타내기 위해 할당되었으며 867–797 cm ⁻¹ 티로신 잔기의 수소 결합 상태를 나타내기 위해 할당되었습니다. 또한 라만 스펙트럼 피크가 1630 cm ⁻¹ 로 상당한 이동 이는 고정된 항체의 3차 구조의 존재에 기인할 수 있다[45](그림 8c). 나의 비율 _디 /나 _G 고정된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 형성으로 인해 더 나은 결정 구조를 나타내는 1.4 ± 0.04로 증가되었습니다.

a의 라만 스펙트럼 이동 CQD, b CQD/ZnO 나노복합체 및 c 고정된 CQD/ZnO-BM 19.21 나노복합체

형광 면역 감지 조건의 최적화

제안된 형광 면역 감지 조건의 선택 및 최적화는 다양한 매개변수를 연구하여 수행되었습니다. 일반적으로 고정된 나노복합체의 양, 사용된 완충액의 pH 및 농도, 혈청 시료의 표적 분석물 사이의 배양 시간 및 면역 감지 시약을 조사하고 최적화해야 합니다. 고정된 CQD/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 적절한 양을 선택하기 위해 10–100 μL 범위의 다른 양을 테스트했습니다. 최대 형광 강도는 고정된 CQD/ZnO-BM 19.21 나노복합체 50 μL를 추가하여 관찰되었습니다(그림 9a). pH .2–7.5 값의 인산염 완충 식염수 용액 4개를 준비하고 형광 강도의 함수로 테스트했습니다. pH 값을 변경하여 형광 신호 강도의 약간의 변화가 관찰되었습니다. pH 7.2와 7.3에서는 고정된 CQDs/ZnO 나노복합체의 화학적 불안정성으로 인해 형광 신호가 감소하였다. 형광 신호는 나노복합체 표면의 단일클론 분자 사이의 우수한 상호작용으로 인해 pH .4에서 7.5로 증가했습니다(그림 9b). pH를 7.5 이상으로 증가시키면 분해될 수 있는 표적 항원의 활성을 유지하기 위해서는 7.4가 가장 적합한 pH 값임을 알 수 있었다. 따라서 추가 연구를 위해 pH 7.4를 선택했습니다.

λ_ex에서 CYFRA 21-1 항원의 형광 측정 최적화 =470 및 λ_em =520 nm. 아 추가된 고정화된 CQD/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 효과, b pH 범위 7.3–7.5, c의 인산염 완충 식염수의 효과 0.01–0.05 mol L ⁻¹ 농도 범위에서 PBS를 사용한 완충액 농도의 효과 , 및 d 10–60 min을 사용한 면역반응 시간의 효과

형광 강도에 대한 인산완충식염수 농도의 영향은 0.01–0.05 mol L ⁻¹ 농도 범위를 사용하여 추정되었습니다. . The maximum fluorescence intensity signal was obtained using the buffer concentration of 0.01 mol L ⁻¹ . At higher buffer concentrations, the immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposite was aggregated, and the instability of the immunosensing solution may cause a decrease in fluorescence intensity (Fig. 9c). To calculate the immunoreaction time, the analytical procedure was repeated using reaction time ranging from 10 to 60 min. The maximum fluorescence intensity signal was observed by maintaining the reaction between the tested antigen and the immunosensing solution for at least 30 min (Fig. 9d).

Analytical Quantification

Under optimized conditions, the suggested immunoassay method was performed using 12 serum samples containing CYFRA 21-1 antigen in concentration range of 0.01–500 ng mL ¹ . The outcome results were plotted to construct the calibration graph which was linear over a concentration range of 0.01–100 ng mL ⁻¹ with a detection limit of 0.008 ng mL ⁻¹ . The calculated equation was found to be I _F  = 7.933C + 181.24 (r ²  = 0.9992). After six repetitions, the percentage of the relative standard deviation (%RSD) was 1.3%. The acceptable results revealed a high sensitivity of the immunosensing fluorescence method for the quantification of CYFRA 21-1 antigen in serum samples.

System Suitability

System suitability was investigated by carrying out a comparative study between the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing method and the previously addressed methods. The suggested fluorescence system provided significant advantages such as simplicity, eco-friendly, and easy to detect the target analyte in serum samples. The recorded results revealed high sensitivity with a wide linear detection range of 0.01–100 ng mL ¹ and lower detection limit of 0.008 ng mL ¹ (표 1).

Accuracy, Precision, and Selectivity of the Immobilized Immunosensing System

To ensure the accuracy of the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescence immunosensing system for the determination of CYFRA 21-1 antigen in serum samples, 12 serum samples were tested. The outcome data were compared with another previously reported technique [6], which was based on electrochemiluminescence assay using tris 2,2′-bipyridyl ruthenium (II) complex to be excited by tripropylamine. Acceptable results were obtained as indicated in Table 2. Intra-day and inter-day assay were used to investigate the precision of the suggested method. The test was carried out using a serum sample containing 10 ng mL ^− 1 of CYFRA 21-1 antigen. The mean relative standard deviations were 1.1% and 1.3% for both intra- and inter-day assay, respectively, which revealed high precision. Furthermore, the selectivity of the suggested method towards the determination of CYFRA 21-1 antigen was evaluated using some possible interfering species such as amino acids (cysteine, lysine, serine, tyrosine, and glycine), some cations (K ⁺ , Na ⁺ , Ca ²⁺ , 마그네슘 ²⁺ , and Zn ²⁺ ) and some other bio-markers such as CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, and CA 125. The test was carried out under optimum conditions using human serum containing 10 ng mL ⁻¹ CYFRA 21-1 antigen in the presence of 10 ng mL ⁻¹ coexisting species. The outcome data were calculated as relative percentage error (Er%) and the corresponding result did not exceed ± 5% for each interfering species (Table 3). The calculated tolerance values (F-F ⁰ /F ⁰ ) were found to be with the tolerance limits (< 5%). Therefore, the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescence system displayed high selectivity towards the determination of CYFRA 21-1 antigen in human serum.

Analysis of Real Specimens

In real human specimens, the suggested immunosensing fluorescence system based on immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution was exploiting to detect and quantify the percentage (%) recoveries of the tumor marker CYFRA 21-1 antigen. As previously mentioned in the immunosensing procedure, the suggested system was used to determine the CYFRA 21-1 antigen by finding the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of CYFRA 21-1 antigen in serum samples. Certain amounts of the target antigen (0.5, 1.0, and 2.0 ng mL ⁻¹ ) were added to the estimated samples, and the increase in signal intensities was evaluated. After six determinations, the percentage relative standard deviations (%RSD) were calculated. The outcome percentage recoveries were found to be ranged from 96.7 ± 0.7 to 100.0 ± 1.3%. The calculated %RSD was in the range of 0.2–1.4%. The tested serum samples were analyzed using a previously reported method [6] and the percentage recoveries were found to be ranged from 96.1 ± 1.6 to 100.0 ± 0.4% with %RSD 0.3–1.7%. In order to ensure the suitability of the suggested immunosensing fluorescence technique using an immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution, a comparative statistical study using Student’s t test and F test [46] was carried out between the present results and those obtained by others from previously conducted methods (Table 4). The obtained t test and F test values were found to be ranged from 0.354 to 2.181 (2.228)* and 1.16 to 4.0 (5.05)* with respect to the tabulated values of P  = 0.05, respectively. The results revealed good agreement between the suggested method and the previously published procedures. Also, all detected quantities of CYFRA 21-1 antigen in serum samples were within the normal limit indicating no lung cancer was diagnosed in the investigated serum samples.