탄소 양자점/산화아연 나노복합체를 이용한 CYFRA 21-1의 신속 고감도 형광 면역분석

요약

인간 혈청에서 종양 표지자 사이토케라틴-19 단편(CYFRA 21-1)을 이용해 폐암을 조기에 신속하게 검출하는 것은 환자 생존과 빠른 외과적 대응에 중요한 역할을 합니다. 본 연구는 녹색 합성된 탄소 양자점-산화아연 나노복합체를 고감도 형광 면역 센싱 용액으로 활용하여 인간 혈청 내 CYFRA 21-1 항원을 빠르게 정량하는 것을 목표로 했습니다. 제안된 방법은 Citrus lemon 껍질을 이용해 탄소 양자점을 제조하는 열수합성법을 적용했습니다. 형성된 탄소 양자점은 아세트산 아연의 환원 및 안정화에 사용되어 탄소 양자점-산화아연 나노복합체를 합성했습니다. 샌드위치 캡핑 항체-항원-항체 면역 센싱 시스템을 형성하기 위해, CYFRA 21-1 항원은 탄소 양자점-산화아연 나노복합체 표면에 고정된 비접합 단일클론 항체 BM 19.21에 의해 포획되고, 다른 단일클론 항체 KS 19.1은 마이크로타이터 웰 표면에 코팅되었습니다. 이 시스템은 λ_ex = 470 nm에서 흥분, λ_em = 520 nm에서 방출로 조정 가능한 형광 특성을 보입니다. 제안된 나노복합체 형광 면역 센싱 시스템은 0.01–100 ng mL⁻¹의 선형 관계와 0.008 ng mL⁻¹의 검출 한계를 나타냈습니다. 탄소 양자점-산화아연 나노복합체 기반 면역 센싱 시스템은 인간 혈청 내 CYFRA 21-1 검출을 통한 폐암의 신속 진단을 위한 유망한 접근법을 제공합니다.

서론

폐암은 가장 흔하고 공격적인 암 유형으로 의학적 치료에 큰 도전을 안겨줍니다. 종양 재발과 전이는 폐암 환자의 주요 사망 원인으로 간주됩니다[1]. 종양 표지자 사이토케라틴 19 단편(CYFRA 21-1)은 많은 정상 및 악성 상피 세포에 존재하는 단편입니다[2]. 이는 샌드위치 면역방사능측정법으로 측정할 수 있습니다. 초기 연구들은 폐암 악성 단계에서 CYFRA 21-1이 환자 혈액 순환으로 방출되어 혈청에서 증가함을 밝혔습니다[3]. 따라서 조기 검출과 그에 따른 빠른 외과적 대응으로 폐암 환자의 생존율을 높일 수 있습니다[4].

CYFRA 21-1 검출을 위한 몇 가지 기술이 이전에 보고되었습니다: 효소 면역분석[5], 전기화학발광 면역분석[6], 면역방사능측정법[7]. 인간 혈청 내 CYFRA 21-1의 감도를 향상시키는 유리한 전략은 여전히 관심사입니다.

최근 몇 년간 나노기술은 거의 모든 생명 분야에서 주요한 진전과 폭발적 성장을 이루었습니다[8]. 해당 분야로는 약물 전달 시스템[9], 의약품 분석[10], 촉매 활성 반응[11], 의약 응용[12], 암 종양 표지자[13], 조직 이미징[14] 등이 있습니다.

요즘 형광(FL) 기반 센싱 기술은 단순한 설계와 뛰어난 감도로 많은 연구자들의 관심을 끌고 있습니다. 다양한 형광 감각 물질이 생물학적 모니터링을 위해 설계되고 합성되었습니다. 생물학적 결정을 위한 형광 시스템은 높은 발광성, 물 분산성, 화학적 안정성, 무독성을 가집니다[15]. 생체표지자 검출을 위한 다양한 면역 센싱 형광 기반 프로브가 있습니다. 비균질 경쟁 분석은 포획 분자를 표면에 고정하고 형광체-접합 생체표지자와 배양하여 수행됩니다. 자유 및 접합 생체표지자가 포획 분자 결합을 위해 경쟁함에 따라 형광 강도가 생체표지자 농도에 따라 감소합니다[16]. 비균질 샌드위치 분석은 포획 분자와 관심 용액을 배양하여 생체표지자와 복합체를 형성하는 기반입니다. 결과적으로 형광 강도는 생체표지자 농도에 따라 증가합니다[17].

균질 경쟁 분석에서, 두 개의 서로 다른 형광체 A-접합 포획 분자와 형광체 B-접합 생체표지자가 배양되고, 용액은 생체표지자 농도에 따라 형광을 증가시킵니다[18]. 그러나 이러한 기술들은 긴 실험 시간, 다중 검출 부족, 복잡성, 때로는 상대적으로 거짓 결과 등의 단점을 보였습니다. 나노기술의 발전으로 연구자들은 독특한 광학적 특성을 가진 새로운 형광 면역 센싱 프로브를 개발할 수 있게 되었습니다[19]. 양자점이 생체분자 검출에 처음 사용된 이후, 적절한 파장 선택의 높은 유연성, 다중 검출을 위한 우수한 표지, 생체적합성, 표적 능력으로 큰 관심을 끌었습니다[20].

탄소 양자점(CQDs)은 우수한 화학적, 물리적, 광학적, 자기적, 전기적 특성을 보여주었습니다. CQDs는 열수, 전기산화, 레이저 절제, 마이크로파 방법 등 다양한 기술로 합성될 수 있습니다[21,22,23,24]. 낮은 독성 특성으로 인해 과학자들은 CQDs를 많은 형광 프로브의 강력한 후보로 간주했습니다. 또한 생화학적, 광화학적, 생체감지, 바이오이미징, 약물 전달 시스템[25,26,27]뿐만 아니라 면역분석 검출[28] 등 다양한 요구에 따라 다른 제어 가능한 화학 반응을 통해 조작할 강한 능력을 가집니다. CQDs 합성에 대한 초기 연구들은 비싼 탄소 공급원, 독성 화학물질 및 시약 사용, 또는 비선택적 공정 사용 등의 단점을 드러냈습니다[29]. 이러한 단점을 제한하기 위해 연구자들은 과일 주스를 탄소의 새롭고 저렴한 공급원으로 사용하기 시작했습니다[30]. 과일 주스 사용이 자원 활용의 최적 목표를 제공하지 못하므로, 최근 과일 껍질에서 형광 CQDs를 얻었습니다[31]. 과일 껍질 사용은 CQDs의 친환경적 녹색 합성을 위한 유망한 경로를 제공합니다.

산화아연(ZnO)은 가장 중요하고 잠재적으로 활성적이며 안정적이고 저독성의 금속 산화물 중 하나로, 자외선 레이저 장치, 생물의학 분야, 다양한 센서, 광촉매에 널리 사용됩니다[32,33,34,35]. 산화아연 나노입자(ZnONPs)는 자외선 및 가시광선 스펙트럼 근방에서 광발광 특성을 보입니다. 이는 전자-정공 쌍의 직접 재결합에 기반한 엑시톤 방출[36] 또는 전도대 가장자리에서 트랩 준위로의 전자 전이에 의한 520 nm에서의 녹색-황색 방출[37]로 설명될 수 있습니다.

일반적으로 탄소 점은 sp² 및 sp³ 탄소, O/N-기반 기, 후수정 화학기를 포함하는 비정질 또는 나노결정 준구형 나노입자입니다. 게다가 CQDs는 더 높은 파장으로 여기될 수 있고 전자-정공 쌍의 결합 표면 효율을 변화시키고 분석 시스템의 소광을 처리할 수 있어 생체분자의 정량적 결정을 용이하게 할 수 있습니다[38]. TiO₂ 및 ZnO 같은 금속 산화물로 장식되어 생체표지자 검출에 활용될 수 있는 광학적으로 활성인 나노복합체를 형성할 수 있습니다. ZnO는 넓은 밴드 갭(3.37 eV)을 가진 물질로, 밴드 갭의 큰 결함 준위 밀도로 인해 자외선 및 청색 가시광선 영역에서 발광할 수 있습니다[39]. CQDs/ZnO 나노복합체 형성은 CQDs와의 ZnO 하이브리드화로 가시광선 흡수를 증가시키고, 발광 흡수의 청색 편이(520 nm)는 이온화된 산소 공공의 복사 재결합에 기인할 수 있습니다. 가시광선 흡수 증가 외에도, 더 나은 전자-정공 분리와 계면 전자 전달 시간 감소는 CQDs와 ZnO 나노입자 하이브리드화의 더 높은 광학적 성능을 위해 고려될 수 있습니다[40]. 게다가 CQDs/ZnO 나노복합체의 물 계면에서 생성된 –OH* 라디칼의 의미 있는 증가는 분석 시스템의 형광 신호를 현저히 높일 수 있습니다. 따라서 결합된 CQDs/ZnO 나노복합체는 ZnO 표면의 광전자 및 광발광 특성 수정을 강화하고 조정 가능한 광발광을 가진 강한 표면 결함을 생성합니다[41]. 또한 생체인식 항체로 고정된 CQDs가 항체-항원-항체 FL-센싱 시스템을 형성하여 표적 분석물에 대한 높은 특이성과 감도를 가진 생존 가능한 프로브를 제공합니다[42].

본 연구는 Citrus lemon 껍질을 탄소 전구체로 사용하여 열수 조건에서 CQDs를 유도하고, 이를 환원 및 안정화제로 이용해 CQDs 접합 ZnO 나노복합체를 합성하는 새로운 단순 초고감도 면역분석 형광 센싱 시스템을 제안했습니다. 제조된 CQDs/ZnO 나노복합체는 비접합 BM 19.21 단일클론 항체(mAb)로 고정되고, 마이크로타이터 웰은 다른 단일클론 KS 19.1 항체로 코팅되어 샌드위치 캡핑 면역 센싱 시스템을 형성했습니다.

재료 및 방법

기기

CQDs 및 CQDs/ZnO 나노복합체의 분광광도 스펙트럼은 Ultrospec 2100-Biochrom 분광광도계(Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, UK)로 기록되었습니다. 녹색 합성된 CQDs 및 CQDs/Zn 나노복합체의 표면 형태와 입자 크기 분포는 투과전자현미경(TEM) JEOL 1200EX 모델(JEOL Ltd., Freising, Germany)과 주사전자현미경(SEM) JSM-7610F 모델(JEOL, USA)로 평가되었습니다. 제안된 면역 센싱 시스템의 형광 및 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 스펙트럼은 Biotek Synergy H1 멀티모드 리더(Biotek, Tokyo, Japan)와 Perkin Elmer FT-IR 분광광도계(PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japan)로 각각 확인되었습니다. 라만 스펙트럼, X-선 광전자 분광법(XPS), X-선 분말 회절(XRD) 패턴은 마이크로 라만 분광계(CRAIC Technologies, CA, USA), Kratos Axis Ultra X-선 분광 시스템(Kratos Analytical Ltd., Manchester, UK), Siemens D-5000 회절계(Siemens, Erfurt, Germany)로 각각 측정되었습니다.

화학물질 및 시약

SG-2000-10090 기기(Barsbuttel, Germany)를 통해 실험 전반에 사용된 탈염수를 획득했습니다. 샌드위치 캡핑 면역 센싱 시스템을 형성하기 위한 CYFRA 21-1 비접합 단일클론 항체(mAb) BM 19.21과 KS 19.1은 Abcam(Cambridge, UK)에서 구입했습니다. Citrus lemon 과일은 지역 시장에서 공급받았습니다. pH 7.4의 인산완충식염수(PBS)는 염화나트륨, 염화칼륨, 수산화나트륨, 일인산칼륨, 이인산나트륨(BHD Ltd. Co. Poole, UK)으로 제조했습니다. Randox Laboratories(Northern Ireland-UK)에서 상업용 정상 혈청을 친히 제공했습니다. 무작위 혈액 샘플은 건강한 자원자들로부터 수집되었으며, 연구 시작 전 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 또한 Sigma-Aldrich(Hamburg, Germany)에서 순수 등급의 카르보디이미드 염산염(EDC)과 N-하이드록시석시니미드(NHS)를 공급했습니다. 킹 사우드 대학 연구윤리위원회(KSA)(KSU-REC-002-E, 2019)에서 연구를 승인했습니다.

탄소 양자점(CQDs)의 녹색 열수 제조

Citrus lemon 껍질을 열수 조건에서 CQDs 합성에 사용했습니다. 약 20 g의 Citrus lemon 껍질과 200 mL 탈염수를 둥근 플라스크에 넣고 지속적인 자기 교반 하에 100 °C에서 6시간 환류했습니다. 실온으로 냉각 후, 결과 추출물을 3500 rpm에서 원심분리하고 상층 추출액 20 mL를 오토클레이브하여 100~200 °C 온도 범위에서 6~120시간 간격으로 열수 조건에서 가열했습니다. 실온으로 냉각 후 상층 액체가 CQDs를 나타냅니다(Scheme 1).

Citrus lemon 껍질을 이용한 CQDs 녹색 합성으로 형광 CQD 용액과 탄소 구체 생성

탄소 양자점-산화아연 나노복합체 제조

CQDs/ZnO 나노복합체를 제조하기 위해 CQDs를 환원 및 안정화제로 사용하는 간단한 화학적 환원 반응을 수행했습니다. CQDs/ZnO 나노복합체는 60 °C에서 지속적인 교반 하에 5.0 × 10⁻² mol L⁻¹ 아세트산 아연 50 mL에 CQDs 20 mL를 첨가하여 얻었습니다. 혼합물 색상이 황색에서 크림색으로 변하면, 환원 공정 완료를 위해 30분간 방치하고 4 °C에서 보관했습니다. 제조된 CQDs/ZnO 나노복합체의 안정성을 확인하고 응집을 체크하기 위해 UV-Vis 분광법으로 390 nm에서 20일간 흡광도를 기록했습니다. 결과는 CQDs/ZnO 나노복합체의 높은 안정성과 흡광도의 유의미한 변화 없음을 보여주었습니다.

탄소 양자점-산화아연 나노복합체 특성 분석

CQDs/ZnO 나노복합체 형성을 확인하기 위해 다양한 현미경 및 분광 기술을 사용했습니다. CQDs와 CQDs/ZnO 나노복합체의 균일성과 표면 형태는 고해상도 투과전자현미경(HRTEM)과 SEM으로 연구했습니다. 광학 스펙트럼은 UV-Vis, FT-IR, XPS, 라만 분광법으로 연구했습니다. 제조된 CQDs의 결정 구조는 XRD 패턴으로 평가했습니다.

고정화 공정

비접합 단일클론 BM 19.21 항체를 아민과 활성 카복실기 사이의 단순한 펩타이드 아미드 결합으로 합성된 CQDs/ZnO 나노복합체 표면에 고정화했습니다. 고정화 공정은 CQDs/ZnO 나노복합체 용액 5.0 mL에 등몰 농도 3.0 × 10⁻³ mol L⁻¹ NHS와 EDC 각각 5.0 mL를 첨가하고 1시간 지속 교반하여 수행했습니다. 약 5 mg 비접합 단일클론 BM 19.21 항체를 0.01 mol L⁻¹ 인산완충식염수(pH 7.4) 1.0 mL에 녹여 위 센싱 용액에 첨가했습니다. 비접합 단일클론 BM 19.21 항체는 37 °C에서 12시간 배양 후 CQDs/ZnO 나노복합체 용액 표면에 고정되었습니다(Scheme 2). 분광광도법으로 고정화 공정 성공을 확인했습니다.

단일클론 BM 19.21 항체의 CQDs/ZnO 나노복합체 표면 고정화

면역분석법의 일반 원리

마이크로타이터 웰 표면을 코팅하는 다른 단일클론 KS 19.1 항체를 사용하여 샌드위치 캡핑 반응 항체-항원-항체를 얻었습니다(Scheme 3). 최적 면역분석 조건에서 CYFRA 21-1 항원 농도는 형광 신호 강도 증가의 함수로 결정되었습니다.

샌드위치 캡핑 면역 센싱 항체-항원-항체 반응을 나타내는 도식

면역 센싱 절차

인간 혈청 검체 수집은 무작위 자원자들에 의해 제공되었습니다. 실온에서 완전한 응고 후 원심분리하고 4 °C에서 보관했습니다. 스파이킹 기법을 사용해 0.01–500 ng mL⁻¹ 농도 범위의 CYFRA 21-1 항원을 함유한 표준 검체를 제조했습니다. 약 50 μL 스파이크 검체를 마이크로타이터 웰에 분주하고, pH 7.4 인산완충식염수로 신선하게 희석한 단일클론 KS 19.1 항체 50 μL와 혼합하여 30분간, 이후 뚜껑 없이 37 °C에서 1시간 배양했습니다. 웰 내용물을 세게 털어내고, 각 웰을 탈염수(300 μL)로 3회 세척했습니다. 약 50 μL 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체 용액을 각 웰에 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 37 °C에서 30분간 배양했습니다. 제조된 검체를 마이크로타이터 리더로 형광 분석하여 강도를 기록했습니다.

결과 및 고찰

탄소 양자점 및 나노복합체의 형태학적 평가

투과전자현미경(TEM)을 사용해 시료 내 CQDs의 표면 형태와 분포를 특성화했습니다. TEM 검사를 위해 제조된 CQDs 현탁액 약 4 μL를 TEM 탄소 그리드 표면에 떨어뜨렸습니다. HRTEM 이미지(그림 1a)에서 격자 간격(0.36 nm)을 가진 균일한 검은 반점이 관찰되어 CQDs 형성을 나타냈습니다. 입자 크기 분포 그래프를 그렸고, 평균 입자 크기는 1.5 ± 0.5 ~ 5.0 ± 0.5 nm 범위였습니다(그림 1b). 얻어진 입자 크기는 형성된 CQDs가 실제로 양자 크기 나노물질임을 증명했습니다. 또한 동적 광산란(DLS)을 수행했고, 평균 입자 크기는 ~ 20 ± 0.2 nm로 나타났습니다. 이전 두 측정 간 차이가 관찰되었습니다. 이전 연구들은 CQDs의 비정질 특성으로 인해 HRTEM이 고배율에서 형성된 CQDs의 결정 격자 구조를 보이지 않는다고 밝혔습니다[43]. 마찬가지로 본 연구에서 탄소의 천연 전구체는 Citrus lemon 껍질이며 유도된 CQDs도 비정질 특성을 보였습니다. 따라서 입자 크기 측정 차이는 형성된 CQDs의 응집, 형성된 탄소 점의 비정질 특성, 각 실험에 관여된 메커니즘, 입자의 수화 역학에 기인할 수 있습니다.

a 직경 5 nm CQDs의 고해상도 투과전자현미경(HRTEM) 이미지와 b TEM 기반 CQDs 크기 분포 그래프

제조된 CQDs/ZnO 나노복합체는 TEM과 SEM으로 조사했습니다. TEM 이미지(그림 2a)에서 CQDs에 부착된 육각형 입자의 존재가 CQDs/ZnO 나노복합체 형성을 나타냈습니다. SEM에서 나노복합체 시료는 전자 흡수와 전하 축적을 방지하기 위해 금으로 코팅했습니다. 가속 전압 15 kV, 배율 ×30,000을 적용했습니다(그림 2b).

a 및 b CQDs/ZnO 나노복합체의 투과전자현미경 및 주사전자현미경 이미지

CQDs의 UV-Vis 및 형광 스펙트럼을 연구했고, 기록된 스펙트럼은 224 nm와 280 nm에서 두 개의 유의미한 피크를 보였으며, 이는 각각 C=C와 C=O의 p~p* 및 n~P* 전이에 기인할 수 있습니다. 또한 CQDs의 형광 스펙트럼은 최대 λ_ex = 360 nm, λ_em = 453 nm에서 두 신호를 보였습니다(그림 3a, b). 게다가 CQDs/ZnO 나노복합체의 UV-Vis 스펙트럼을 연구했습니다. 370 nm에서 유의미한 흡수 피크가 관찰되어 청색-녹색 편이를 보였습니다(그림 4a). CQDs/ZnO 나노복합체의 광발광(PL) 특성을 연구했습니다. CQDs의 크기와 표면 결함은 발광 특성에 큰 영향을 미칩니다. 여기 파장의 함수로 CQDs의 (PL) 방출이 변했습니다[38]. 또한 ZnO 나노입자는 청색-녹색 흡수 가시광선 영역에서 결함 관련 방출을 보였습니다[41]. 따라서 CQD-장식 ZnONPs는 PL 방출을 위한 우수한 나노복합체를 생성했습니다. 그림 4b에 보인 바와 같이, CQDs/ZnO의 PL 스펙트럼은 여기 파장 470 nm 후 520 nm에서 유의미한 피크를 가진 청색 편이를 보였습니다. 관찰된 편이는 CQDs와 ZnONPs 에너지 밴드 간 중첩에 기인할 수 있습니다. 표시된 청색 편이는 결함 방출 준위 2.1 eV에 있었습니다.

CQDs 분광 스펙트럼 (a) 224 및 280 nm에서 UV-Vis 스펙트럼, (b) λ_ex = 360, λ_em = 452 nm에서 CQDs 형광 스펙트럼

CQDs/ZnONPs 분광 스펙트럼 a 370 nm 흡수 피크에서 UV-Vis 스펙트럼, b λ_ex = 470, λ_em = 520 nm에서 CQDs/ZnONPs 광발광 스펙트럼

CQDs/ZnO 나노복합체 형성과 비접합 단일클론 BM 19.21 항체로 고정된 CQDs/ZnO 나노복합체 확인을 위해 비교 FT-IR 연구를 수행했습니다. CQDs의 기록된 FT-IR 스펙트럼은 특정 작용기에 해당하는 여러 뚜렷한 피크를 드러냈습니다: 3462 cm⁻¹과 2932 cm⁻¹에서 C–OH와 C–H 기의 신축 진동 피크. 또한 1749 cm⁻¹, 1375 cm⁻¹, 1246 cm⁻¹에서 세 진동 흡수 밴드가 관찰되어 각각 C=O, C–N, C–O–C 작용기 존재에 해당했습니다(그림 5a). Zn–O의 신축 진동대에 해당하는 436 cm⁻¹에서 새로운 피크가 관찰되었습니다. CQDs의 환원 및 안정화 특성은 표면의 –OH와 COOH 기 존재에서 얻었습니다. 이들 작용기는 전자 공여체 역할을 하며 CQDs/ZnO 나노복합체 형성에 강한 친화성을 가집니다. 따라서 CQDs는 형성된 나노복합체를 환원하고 안정화했습니다(그림 5b). 그림 5c에 묘사된 바와 같이, 3254 cm⁻¹과 1675 cm⁻¹에서 두 개의 새로운 피크가 형성되었습니다. 이 피크들은 각각 N–H와 C=O의 신축 진동에 기인하며, 펩타이드 결합을 통한 CQDs/ZnO-BM 19.21 고정화를 확인했습니다.

FT-IR 스펙트럼 a CQDs, b CQDs/ZnO 나노복합체, c 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체

녹색 합성된 CQDs의 X-선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼을 조사했습니다. 얻어진 CQDs 스펙트럼(그림 6a)은 288 및 286 eV에서 C=O와 COOH에 대한 서로 다른 작용기를 보였습니다. 또한 1044.4 및 1021.5 eV에서 Zn 2p_1/2와 Zn 2p_3/2에 대한 두 개의 유의미한 결합 에너지 피크가 관찰되었습니다(그림 6b). 게다가 CQDs/ZnO 나노복합체의 고해상도 XPS 스펙트럼은 560, 385, 350, 246, 200 eV에서 O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p, Zn 3d에 대한 서로 다른 결합 에너지 피크 존재를 확인했습니다(그림 6c). 앞서 언급한 모든 데이터는 CQDs 표면에 ZnO 존재로 CQDs/ZnO 나노복합체 형성을 증명했습니다.

X-선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼 a CQDs, b ZnO, c CQDs/ZnO 나노복합체

CQDs와 CQDs/ZnO 나노복합체의 XRD 패턴 비교 연구를 수행했습니다. CQDs의 XRD 패턴에서 탄소 점에 대한 20°(2Ɵ)의 넓은 피크가 관찰되었습니다(그림 7a). 그러나 Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004), (202)에 각각 해당하는 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78°, 80°(2Ɵ)에서 다른 예리한 피크들이 인식되었습니다. 관찰된 피크들은 CQDs 표면에 ZnO 분포로 CQDs/ZnO 나노복합체 형성을 반영했습니다(그림 7b).

X-선 회절 패턴 a CQDs, b CQDs/ZnO 나노복합체

제조된 CQDs, CQDs/ZnO, 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 라만 스펙트럼을 연구했습니다. 라만 신호는 결정 구조와 결함을 연구하는 데 흔히 사용됩니다. 그림 8a는 탄소 나노입자에 대한 전형적인 D 및 G 밴드를 1300 및 1520 cm⁻¹에서 보여주었습니다. 이전 보고에 따르면 D-밴드는 일반적으로 sp³ 결함을 나타내고, G-밴드는 sp²-결합 탄소의 평면 진동 특징입니다[44]. 제조된 CQDs에 대한 I_D/I_G 비율을 계산했고, 1.02 ± 0.03으로 나타났습니다. ZnO 나노입자에 대한 440 및 520 cm⁻¹에서 새로운 예리한 피크가 관찰되었고, CQDs의 전형적 피크는 1364 및 1595 cm⁻¹에서 관찰되었습니다. I_D/I_G 비율은 1.2 ± 0.01로 나타나 CQDs/ZnO 나노복합체 형성을 나타냈습니다(그림 8b). 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체의 라만 스펙트럼은 이차 및 삼차 구조의 확인 신호로 쉽게 인식할 수 있는 수많은 피크를 보였습니다. 1007–1128 cm⁻¹ 영역에서 관찰된 피크들은 단일클론 항체의 주요 이차 구조를 나타내도록 할당되었습니다. 550–682 cm⁻¹ 영역의 라만 피크들은 이황화물构象을 나타내도록 할당되었고, 867–797 cm⁻¹ 영역은 티로신 잔기의 수소 결합 상태를 나타내도록 할당되었습니다. 또한 라만 스펙트럼 피크의 1630 cm⁻¹으로의 유의미한 이동은 고정화된 항체의 삼차 구조 존재에 기인할 수 있습니다[45](그림 8c). I_D/I_G 비율은 1.4 ± 0.04로 증가하여 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체 형성으로 인한 더 나은 결정 구조를 드러냈습니다.

라만 스펙트럼 이동 a CQDs, b CQDs/ZnO 나노복합체, c 고정화된 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체

형광 면역 센싱 조건 최적화

제안된 형광 면역 센싱 조건의 선택과 최적화는 다양한 매개변수 연구로 수행되었습니다. 일반적으로 고정화된 나노복합체 양, 사용된 완충액의 pH와 농도, 혈청 검체 내 표적 분석물과 면역 센싱 시약 간 배양 시간이 조사되고 최적화되어야 합니다. 적절한 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체 양을 선택하기 위해 10–100 μL 범위의 다양한 양을 테스트했습니다. 최대 형광 강도는 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체 50 μL 첨가 시 관찰되었습니다(그림 9a). pH 7.2–7.5 값의 네 가지 인산완충식염수 용액을 제조하고 형광 강도의 함수로 테스트했습니다. pH 값 변경에 따라 형광 신호 강도의 미세한 변화가 관찰되었습니다. pH 7.2와 7.3에서 고정화 CQDs/ZnO 나노복합체의 화학적 불안정성으로 형광 신호가 감소했습니다. 단일클론 분자들이 나노복합체 표면에서 우수한 상호작용으로 인해 pH 7.4~7.5에서 형광 신호가 증가했습니다(그림 9b). 7.4가 표적 항원 활성을 유지하는 데 가장 적합한 pH 값으로 나타났으며, pH를 7.5 이상으로 높이면 항원이 분해될 수 있습니다. 따라서 pH 7.4를 추가 연구에 선택했습니다.

λ_ex = 470, λ_em = 520 nm에서 CYFRA 21-1 항원 형광 결정 최적화. a 첨가된 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체 효과, b pH 범위 7.3–7.5 인산완충식염수 효과, c 0.01–0.05 mol L⁻¹ 농도 범위 PBS 사용 시 완충액 농도 효과, d 10–60분 면역반응 시간 효과

인산완충식염수 농도가 형광 강도에 미치는 영향을 0.01–0.05 mol L⁻¹ 농도 범위로 추정했습니다. 최대 형광 강도 신호는 0.01 mol L⁻¹ 완충액 농도에서 얻었습니다. 더 높은 완충액 농도에서 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 나노복합체가 응집되었고, 면역 센싱 용액의 불안정성으로 형광 강도가 감소할 수 있습니다(그림 9c). 면역반응 시간을 계산하기 위해 10~60분 범위의 반응 시간으로 분석 절차를 반복했습니다. 최대 형광 강도 신호는 검사 항원과 면역 센싱 용액 간 반응을 최소 30분 유지 시 관찰되었습니다(그림 9d).

분석적 정량

최적화된 조건에서, 제안된 면역분석법은 0.01–500 ng mL¹ 농도 범위의 CYFRA 21-1 항원을 함유한 12개 혈청 검체로 수행되었습니다. 결과는 검량선을 구성하기 위해 플로팅되었고, 0.01–100 ng mL⁻¹ 농도 범위에서 선형적이었으며 검출 한계는 0.008 ng mL⁻¹이었습니다. 계산된 방정식은 I_F = 7.933C + 181.24 (r² = 0.9992)로 나타났습니다. 6회 반복 후 상대표준편차 백분율(%RSD)은 1.3%였습니다. 허용 가능한 결과는 혈청 검체 내 CYFRA 21-1 항원 정량을 위한 면역 센싱 형광법의 높은 감도를 드러냈습니다.

시스템 적합성

시스템 적합성은 제안된 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 면역 센싱법과 이전에 다룬 방법들 간 비교 연구로 조사되었습니다. 제안된 형광 시스템은 단순성, 친환경성, 혈청 검체 내 표적 분석물 쉬운 검출 등의 유의미한 이점을 제공했습니다. 기록된 결과는 0.01–100 ng mL¹의 넓은 선형 검출 범위와 0.008 ng mL¹의 낮은 검출 한계로 높은 감도를 드러냈습니다(표 1).

고정화 면역 센싱 시스템의 정확도, 정밀도, 선택성

제안된 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 형광 면역 센싱 시스템의 혈청 검체 내 CYFRA 21-1 항원 결정 정확도를 보장하기 위해 12개 혈청 검체를 테스트했습니다. 결과 데이터는 트리스 2,2'-비피리딜 루테늄(II) 복합체를 삼프로필아민으로 여기시키는 전기화학발광 분석 기반의 이전에 보고된 기술[6]과 비교했습니다. 표 2에 나타난 바와 같이 허용 가능한 결과를 얻었습니다. 일내 및 일간 분석을 사용해 제안된 방법의 정밀도를 조사했습니다. 테스트는 CYFRA 21-1 항원 10 ng mL⁻¹을 함유한 혈청 검체로 수행했습니다. 평균 상대표준편차는 일내 및 일간 분석 각각 1.1%와 1.3%로 높은 정밀도를 드러냈습니다. 게다가 제안된 방법의 CYFRA 21-1 항원 결정 선택성을 일부 가능한 간섭 물질로 평가했습니다: 아미노산(시스테인, 라이신, 세린, 티로신, 글리신), 일부 양이온(K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺), 다른 생체표지자(CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, CA 125). 테스트는 최적 조건에서 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 항원을 함유한 인간 혈청에 10 ng mL⁻¹ 공존 종 존재 하에 수행되었습니다. 결과 데이터는 상대 백분율 오차(Er%)로 계산되었고, 각 간섭 물질에 대한 해당 결과는 ±5%를 초과하지 않았습니다(표 3). 계산된 허용값(F-F⁰/F⁰)은 허용 한계(< 5%) 내에 있었습니다. 따라서 제안된 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 면역 센싱 형광 시스템은 인간 혈청 내 CYFRA 21-1 항원 결정에 높은 선택성을 보였습니다.

실제 검체 분석

실제 인간 검체에서, 제안된 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 용액 기반 면역 센싱 형광 시스템을 이용해 종양 표지자 CYFRA 21-1 항원의 회수율(%)을 검출하고 정량했습니다. 앞서 면역 센싱 절차에서 언급한 바와 같이, 제안된 시스템은 형광 강도와 혈청 검체 내 CYFRA 21-1 항원 농도 간 관계 발견으로 CYFRA 21-1 항원을 결정하는 데 사용되었습니다. 표적 항원 특정량(0.5, 1.0, 2.0 ng mL⁻¹)을 추정 검체에 첨가하고 신호 강도 증가를 평가했습니다. 6회 결정 후 백분율 상대표준편차(%RSD)를 계산했습니다. 결과 회수율은 96.7 ± 0.7 ~ 100.0 ± 1.3% 범위였습니다. 계산된 %RSD는 0.2–1.4% 범위였습니다. 테스트된 혈청 검체는 이전에 보고된 방법[6]으로 분석되었고, 회수율은 96.1 ± 1.6 ~ 100.0 ± 0.4% 범위, %RSD 0.3–1.7%였습니다. 제안된 고정화 CQDs/ZnO-BM 19.21 용액 사용 면역 센싱 형광 기술의 적합성을 보장하기 위해, Student's t 검정과 F 검정[46]을 사용한 비교 통계 연구를 현재 결과와 이전에 수행된 방법들로부터 얻은 결과 간에 수행했습니다(표 4). 얻어진 t 검정과 F 검정 값은 표 4에 표시된 대로 P = 0.05에 대한 표 값 2.228*과 5.05*에 대해 각각 0.354~2.181, 1.16~4.0 범위였습니다. 결과는 제안된 방법과 이전에 발표된 절차 간 좋은 일치를 드러냈습니다. 또한 혈청 검체에서 검출된 모든 CYFRA 21-1 항원 양은 정상 한계 내에 있어 조사된 혈청 검체에서 폐암이 진단되지 않았음을 나타냈습니다.

결론

본 연구는 Citrus lemon을 전구체로 사용한 녹색 합성 CQDs와 ZnO 나노복합체 제조에 관한 것입니다. CQDs/ZnO 나노복합체는 단순한 펩타이드 결합을 통해 단일클론 BM 19.21 항체를 고정화하여 새로운 형광 면역 센싱 시스템을 형성하는 데 사용되었습니다. 고감도 형광 시스템은 인간 혈청 내 폐암 종양 표지자(CYFRA 21-1) 결정에 사용되었습니다. CYFRA 21-1 항원은 마이크로타이터 웰을 코팅하는 다른 단일클론 항체 KS 19.1을 사용한 샌드위치 캡핑 항체-항원-항체 반응으로 결정되었습니다. 제안된 시스템의 독특한 특성과 높은 감도는 표적 종양 표지자를 높은 안정성과 재현성으로 결정하는 것을 용이하게 합니다. 비교 연구를 수행했고, 결과는 제안된 면역 센싱 시스템의 적합성과 높은 감도를 확인했으며, 결과는 이전에 보고된 기존 기술과 일치했습니다.