독소루비신이 탑재된 Gint4.T-변형 DNA 사면체는 PDGFRβ를 표적으로 하여 신경교종 세포 증식을 억제합니다.

방법

자료

모든 DNA 올리고뉴클레오티드 및 2'F-Py RNA 올리고뉴클레오티드는 Sangon Biotech(중국 상하이)에서 구입했으며 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 표 1에 나열되어 있습니다. GelRed DNA 겔 염색 용액은 Sangon Biotech에서 구입했습니다. 소태아혈청(FBS)과 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)는 모두 Thermo Fisher(미국 뉴욕)에서 구입했습니다. 독소루비신(DOX)은 Mengbio Technology(중국 충칭)에서 구입했습니다. U87MG 세포는 Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library(중국 상하이)에서 구입했습니다. DAPI는 Zhongshan Golden Bridge Biotechnology(중국 베이징)에서 구입했습니다.

DNA 나노구조의 준비

DNA 사면체(표 1)를 조립하기 위해 각 올리고뉴클레오티드(S1, S2, S3 및 S4) 2 μL를 TM 완충액(10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 , pH =8). 그런 다음 DNA 용액을 5분 동안 95°C로 가열한 다음 Bio-Rad PCR 기계(미국 캘리포니아주)를 사용하여 2분 동안 4°C로 냉각했습니다[26, 27]. TDN의 최종 농도는 2 μM이었다. TDN'은 S1을 S1'으로 대체한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 준비했습니다. Apt-TDN을 합성하기 위해 Gint4.T 앱타머를 동일한 몰비로 TDN에 첨가하고 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 합성 전에 압타머는 짧은 변성-재생 단계를 거쳤습니다(5분 동안 85 °C, 2분 동안 급속 냉각 후 10분에 걸쳐 37 °C로 가온)[25].

아가로스 겔 전기영동

아가로스 겔(3%)을 0.5X TEB 완충액에서 100 V에서 30분 동안 실행했습니다. 전기영동 장치의 온도는 장치를 얼음조에 넣어 0 °C로 유지하였다. 전기영동 전에 GelRed를 agarose gel에 첨가하여 DNA 가닥을 염색했습니다. 과정이 끝나면 Bio-Rad 형광 스캐너(California, USA)를 사용하여 젤의 이미지를 캡처했습니다.

동적 광산란

TDN의 유체역학적 크기와 제타 전위를 측정하기 위해 Malvern Zetasizer ZS90(Malvern, UK)이 사용되었습니다. 총 1 mL의 TDN(100 nM)이 동적 광산란(DLS) 분석을 거쳤습니다.

원자력 현미경 이미징

TDN을 TM 완충액(MgCl2를 함유하는 Tris-HCl 완충액)을 사용하여 100 nM으로 희석했습니다. ). 그런 다음, 10 μL의 각 TDN 샘플을 새로 절단된 운모에 첨가하고 10분 동안 인큐베이션했습니다. 샘플은 이후 AC 모드(Agilent 5500, USA)에서 AFM(Atomic Force Microscopy) 기기로 이미지화되었습니다.

준비된 TDN의 약물 로딩 용량 측정

독소루비신을 탈이온수에 용해시켜 500μM 저장 용액을 만들었다. 다양한 농도(1~20 μM)의 독소루비신을 실온(24~26 °C)에서 6 시간 동안 TDN(100 nM) 또는 Apt-TDN(100 nM)과 혼합했습니다. 그런 다음 혼합 용액을 12,000×g에서 원심분리했습니다. 10 분 동안 약물이 로딩된 TDN을 얻습니다. 그 다음, 50 μL의 상층액을 제거하고 PBS와 1:1 비율로 혼합하였다. Varioskan LUX 마이크로플레이트 리더(미국 캘리포니아)를 사용하여 독소루비신(λ _예 =480 nm 및 λ _그들 =590 nm) 상등액에서 독소루비신의 양을 결정합니다[28]. TDN에 로딩된 독소루비신의 농도는 표준 곡선과 형광 강도에 의해 계산되었다. 우리는 또한 증가하는 몰비로 독소루비신과 TDN을 혼합했습니다.

시험관 내 TDN의 혈청 안정성

TDN을 완전 배지와 혼합하고 37°C에서 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 24시간 동안 배양했습니다. TDN 용액을 FBS와 1:1 비율로 혼합하고 37°C에서 1, 3, 5 또는 7시간 동안 배양했습니다. 인큐베이션 후 혼합물을 3% 아가로스 겔에서 실행했습니다.

시험관 내 TDN의 세포독성

1 × 10 ⁴ 농도의 TDN, U87MG 세포의 세포독성을 결정하기 위해 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 세포 배양 배지를 제거하고 0–500 nM TDN을 포함하는 새로운 배지를 추가하고 밤새 배양한 후 추가로 24시간 및 48시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 각 웰에 10 ㎕의 CCK-8 용액을 첨가하고 혼합물을 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정했습니다.

형광 이미징

DOX 및 TDN의 세포 흡수는 형광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 연구되었습니다. U87MG 세포는 10% 열 불활성화 소태아 혈청 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 배지가 있는 24웰 플레이트의 커버슬립에 접종하고 5% CO가 있는 습한 분위기에서 37°C에서 최소 1일 동안 성장시켰다. 2 세포가 적어도 75% 합류에 도달할 때까지. 인큐베이션 후, 배양 배지를 제거하였다. 100 nM Cy3-TDN 및 Cy3-Apt-TDN을 함유하는 완전 배지를 첨가하고 3 시간 동안 배양하였다. TDN 및 Apt-TDN을 Cy3로 표지하여 나노입자의 세포간 흡수를 검출하였다. DOX의 세포 흡수를 평가하기 위해 DOX(DOX 2 μM), DOX@TDN(DOX 2 μM) 및 DOX@Apt-TDN(DOX 2 μM)을 U87MG 세포에 첨가하고 3 시간 동안 배양했습니다. 3시간의 처리 후, 세포를 암실에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음, 5분 동안 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 형광현미경으로 관찰하였다.

유세포분석

총 1 × 10 ⁶ U87MG 세포를 6웰 플레이트에 이식했습니다. 밤새 배양한 후, 배양 배지를 제거하고 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN, 또는 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM 유리 Apt가 보충된 배지를 첨가하고 3 시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 세포를 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 유세포 분석기를 사용하여 Cy-3 양성 세포의 백분율을 분석했습니다.

세포 주기 및 세포자멸사

DOX, DOX@TDN 또는 DOX@Apt-TDN으로 24 h, 5 × 10 ⁵ 처리 후 세포를 수집하고 밤새 75% 빙냉 에탄올에 고정시켰다. 그런 다음, 세포를 RNase 및 propidium iodide와 함께 30분 동안 37°C의 암실에서 인큐베이션했습니다. 세포 주기는 유세포 분석에 의해 조사되었습니다. 또한, 다른 처리 후 세포를 Annexin V-FITC/DAPI로 염색하여 초기 세포자멸사를 조사했습니다.

CCK-8 분석

세포 생존력을 결정하기 위해 U87MG 세포(5 × 10 ³ )를 100μL의 배지가 포함된 96웰 플레이트에 접종하고 5% CO2를 포함하는 대기 하에 37°C에서 밤새 배양했습니다. . 이후에 배지를 제거하고 DOX, DOX-TDN 또는 DOX-Apt-TDN을 포함하는 새로운 배지를 추가했습니다. 24시간 배양 후 CCK-8 용액 10μL를 첨가하고 1시간 더 배양하였다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다.

통계 분석

이 연구의 모든 실험은 3중으로 수행되었으며 모든 데이터는 표준 편차(평균 ± SD)와 함께 평균값으로 표시됩니다. 통계분석은 SPSS 24.0 프로그램(IBM, USA)을 이용하여 수행하였다. 학생의 t 테스트, P <0.05는 그룹 간의 상당한 차이를 나타냅니다.

결과

TDN 및 Apt-TDN의 합성 및 특성화

TDN은 이전에 보고된 바와 같이 단일 단계 합성을 통해 4개의 올리고뉴클레오티드(표 1)에서 자가 조립되었습니다[18, 29]. 종양 표적 앱타머 Gint4.T는 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 TDN을 수정하는 데 사용되었습니다. DNA 사면체는 4개의 면을 포함하며 각 면은 하나의 올리고뉴클레오티드로 구성됩니다. 따라서 4개의 올리고뉴클레오티드가 서로 혼성화되어 DNA 사면체를 형성합니다(그림 1a). 겔 전기영동 분석은 레인 4와 5에서 하나의 두드러진 밴드를 보여 TDN과 Apt-TDN이 성공적으로 구성되었음을 시사합니다. Apt-TDN의 이동성은 TDN에 비해 감소하여 Gint4.T aptamer가 TDN을 성공적으로 수정했음을 시사합니다.

아 DNA 사면체와 Gint4.T-TDN의 합성. 레인 1:S1; 레인 2:S1+S2; 레인 3:S1+S2+S3; 레인 4:S1+S2+S3+S4(TDN); 레인 5:Apt-tail(Gint4.T)과 혼합된 TDN; Apt-TDN. 핵산 염료는 단일 가닥 DNA를 제대로 염색할 수 없기 때문에 레인 1은 보이지 않았습니다. ㄴ AFM 이미지는 TDN과 Apt-TDN의 높이가 ~ 2 nm임을 보여주었다. ㄷ 동적 광산란(DLS)에 의한 TDN 및 Apt-TDN의 입자 크기 및 제타 전위 측정. TDN 및 Apt-TDN의 평균 입자 크기는 각각 10.10 nm(A) 및 13.54 nm(B)였습니다. TDN 및 Apt-TDN의 평균 제타 전위는 각각 -5.69 mV(C) 및 -7.3 mV(D)였습니다.

TDN 및 Apt-TDN의 크기는 DLS 및 AFM에 의해 결정되었습니다. TDN 및 Apt-TDN은 Gint4.T 리간드의 첨가를 반영하여 각각 10.1 nm 및 13.5 nm의 입자 크기를 나타내었다(도 1c(A), (B)). 유체역학적 직경은 물 분자를 포함하기 때문에 입자는 이론적인 크기보다 컸습니다. AFM 이미지에 의해 결정된 TDN과 Apt-TDN의 높이는 ~ 2 nm였으며(그림 1b), 이는 앱타머 변형이 3D 구조를 변경하지 않았음을 나타냅니다. TDN과 Apt-TDN의 평균 제타 전위는 각각 - 5.69 mV(C)와 - 7.3 mV(D)였다(Fig. 1c(C)(D)). 이러한 매개변수를 기반으로 TDN과 Apt-TDN이 성공적으로 조합되었다는 결론을 내렸습니다.

시험관 내 TDN의 안정성 및 세포독성

겔 전기영동 분석은 TDN이 37 °C에서 24 h 동안 완전 배지에서 배양될 때 손상되지 않은 채로 남아 있음을 보여주었습니다(그림 2a(A)). 또한, 소태아혈청의 농도를 50%로 높였을 때 TDN은 적어도 7 h 동안 안정적으로 유지되었으며(Fig. 2a(B)), 이는 이전 보고서[18, 26]와 일치합니다. 나노구조의 세포독성을 결정하기 위해 CCK-8 분석을 사용하여 여러 농도에서 TDN으로 처리한 후 U87MG 세포의 세포 생존력을 평가했습니다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 0-500 nM에서 24 h 및 48 h 동안 TDN으로 처리한 U87MG 세포에서 유의한 세포독성이 관찰되지 않았다. 따라서 DNA 나노입자는 약물 전달을 위한 안정적이고 생물학적으로 안전한 운반체로 사용될 수 있습니다.

아 겔 전기영동은 TDN이 37 °C의 완전 배지에서 24 시간 동안 안정적으로 유지되었음을 보여주었다(A); TDN은 소태아혈청의 농도가 50%(B)로 증가했을 때 7시간 동안 안정적으로 유지되었습니다. ㄴ U87MG 세포는 24시간 및 48시간 동안 다양한 농도(10–500 nM)에서 TDN과 공동 배양되었습니다. CCK-8 분석 결과 U87MG 세포의 활성은 영향을 받지 않았으며 이는 TDN의 생물학적 안전성을 나타냅니다.

TDN 및 Apt-TDN의 약물 적재 용량

독소루비신은 DNA 이중 가닥으로 삽입될 수 있는 광범위한 화학요법 약물입니다. 우리는 표준 독소루비신 곡선(그림 3a)을 계산한 다음 독소루비신이 TDN으로 삽입되는 것을 조사했습니다. TDN 및 Apt-TDN에 삽입된 독소루비신의 양은 독소루비신 농도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하였다. 독소루비신 농도가 14 μM일 때, TDN과 Apt-TDN에 삽입된 독소루비신의 양은 각각 5.5 μM과 6.0 μM에서 정점을 이루었고, 이후 안정되어(그림 3b), DNA 가닥이 완전히 채워졌음을 나타냅니다. 한편, 우리는 몰비를 증가시키면서 독소루비신과 TDN을 혼합하였다. 분석을 위해 독소루비신의 형광 스펙트럼을 스캔했습니다. 도 3c에 도시된 바와 같이, 독소루비신의 형광 스펙트럼은 0.05의 몰비에서 독소루비신으로 켄칭되었다. 이러한 발견을 바탕으로 우리는 단일 TDN에 약 55개의 독소루비신 분자가 포함되어 있는 반면 단일 Apt-TDN에는 60개의 분자가 포함되어 있다는 결론을 내렸습니다.

아 PBS 완충액에서 DOX 농도의 표준 곡선; λex =480 nm 및 λem =590 nm. TDN 및 Apt-TDN에 의해 ​​운반되는 DOX의 양. ㄴ DOX는 TDN 및 Apt-TDN의 이중 가닥 DNA에 삽입되었습니다. DOX 농도가 14 μM에 도달하고 TDN 및 Apt-TDN의 삽입된 DOX 농도가 각각 5.5 μM 및 6.0 μM에서 정점에 이르렀을 때 단일 DNA 사면체는 55개의 Dox 분자를 운반할 수 있는 반면 단일 앱타머로 변형된 DNA 사면체는 60 DOX를 운반할 수 있었습니다. 분자. ㄷ 상등액에서 DOX의 형광 스펙트럼. 독소루비신은 증가하는 몰비(위에서 아래로 0, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01 및 0.05)로 TDN과 혼합되었습니다. 몰비가 1:20일 때 형광이 소멸됨

Apt-TDN의 표적 세포 이용

DNA는 음전하를 띤 거대 분자로 음전하를 띤 세포막으로 들어가기가 어렵습니다. 일반적으로 개별 DNA 분자는 형질감염 시약의 도움으로 세포에 접근해야 합니다. 여기에서 우리는 나노 입자의 세포 내 흡수를 모니터링하기 위해 Cy3으로 TDN 및 Apt-TDN에 레이블을 지정했습니다. U87MG 세포와 3시간 동안 배양한 후, 세포 세포질에서 적색 Cy3 형광 신호가 나타났는데, 이는 TDN이 세포막에 결합하고 형질감염제의 도움 없이 세포 내로 흡수되었음을 나타냅니다(그림 4a). Apt-TDN은 더 높은 적색 형광을 보여 Gint4.T aptamer의 존재가 U87MG 세포에 의한 DNA 사면체 흡수를 유의하게 증가시켰음을 시사합니다. 그러나 유리 압타머를 첨가하면 Cy3 형광이 TDN 단독에서 관찰되는 수준으로 감소하였다. 유리 압타머에 의한 경쟁적 억제로 인해, 우리는 TDN 상의 압타머가 TDN의 흡수를 촉진할 수 없다고 추론한다. 이러한 경쟁적 억제를 기반으로 Apt-TDN이 U87MG 세포를 표적으로 삼을 수 있음을 입증했습니다. 유세포 분석은 Cy3-양성 U87MG 세포의 비율이 TDN 그룹보다 Apt-TDN 그룹에서 더 높다는 것을 추가로 입증했습니다. Free Apt는 Apt-TDN 그룹에서 Cy3-양성 U87MG 세포의 비율을 감소시켰습니다(그림 4b).

아 TDN 및 Apt-TDN(TDN-Gint4.T)의 U87MG 세포 흡수. TDN은 트랜스펙션 에이전트 없이 직접 U87MG 세포에 들어갔고 Apt-TDN(앱타머 Gint4.T에 연결됨)의 흡수가 크게 증가하고 유리 Apt(Gint4.T)에 의해 경쟁적으로 억제되어 앱타머 Gint4.T가 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 세포 표적에 중요한 역할. 눈금 막대는 50 μm를 나타냅니다. ㄴ 유세포 분석 곡선은 3 h

DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN의 세포 이용

우리는 약물 흡수 효율을 평가하기 위해 독소루비신의 특징적인 형광 스펙트럼을 활용했습니다. 처리 3 시간 후, 세포내 독소루비신은 형광 현미경으로 이미지화되었다(그림 5a). 유리 독소루비신은 U87MG 세포에 들어갈 수 있고 핵에 위치했습니다. DOX@TDN의 첨가로, 형광은 유리 독소루비신의 형광보다 더 높았다. 이 결과는 DNA 나노입자가 독소루비신의 세포 흡수를 향상시켰음을 시사한다. DOX@Apt-TDN을 첨가했을 때 핵의 적색 신호는 DOX@TDN이 첨가된 세포보다 훨씬 높았다. DOX의 세포 내 흡수에 대한 반정량적 분석은 Apt-TDN이 단일 약물에 비해 세포 내 DOX 흡수의 2배 이상 증가를 촉진한다는 것을 추가로 확인했습니다. 우리는 이것이 수용체에 대한 Gin4.T 특이적 결합으로 인한 것으로 추론하고, 이에 따라 더 많은 나노입자가 세포에 들어갈 수 있습니다. 리소좀에서 소화된 후 독소루비신은 세포질로 방출되어 핵에서 추가 기능을 할 수 있습니다.

아 DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN의 세포 흡수. 앱타머 Gint4.T로 수정된 Apt-TDN은 TDN보다 U87MG 세포에 더 많은 독소루비신을 전달할 수 있습니다. 또한 TDN은 약물 단독보다 더 많은 약물을 세포에 전달할 수 있습니다. 눈금 막대는 50 μm를 나타냅니다. ㄴ PBS, DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN 처리를 사용한 독소루비신의 형광 강도의 반정량적 분석(blank와 비교:*p <0.05, **p <0.01)

DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN의 세포독성

세포 독성 연구를 위해 U87MG 세포의 3개 그룹을 서로 다른 농도의 독소루비신으로 처리했습니다(그림 6a). IC₅₀ 독소루비신의 값은 DOX 처리의 경우 13.39 μM, DOX@TDN 처리의 경우 7.826 μM, DOX@Apt-TDN 처리의 경우 4.205 μM이었습니다. 세 가지 처리 중 DOX@Apt-TDN이 24 h에서 가장 높은 세포독성을 나타내어 U87MG 세포에 대한 Apt-TDN의 특이성을 나타냈다. 24시간 후, DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN 그룹의 세포를 수집하여 초기 세포자멸사를 탐색하는 데 사용했습니다. 우리의 데이터는 다른 두 그룹보다 DOX@Apt-TDN 그룹에서 조기 세포자멸사 비율이 더 높다는 것을 보여주었습니다(그림 6b). 또한, G0/G1기의 세포 비율은 DOX 및 DOX-TDN 그룹에 비해 DOX-Apt-TDN 그룹에서 증가했습니다(p <0.01), DOX-Apt-TDN 군에서 S기 세포의 비율이 감소하였다(p <0.01) (그림 6c). G2 단계에서 세포의 백분율은 변경되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).

아 다양한 농도에서 DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN의 세포독성. U87MG 세포의 억제율은 DOX 농도가 증가함에 따라 유의하게 증가하였지만, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN 그룹은 DOX 그룹에 비해 유의하게 증가된 세포독성을 나타내었다. DOX@Apt-TDN 그룹의 세포 억제율도 DOX@TDN 그룹보다 유의하게 높았습니다(DOX에 비해 **p < 0.05; DOX와 비교하여 ***p <0.01; DOX@Apt-TDN과 비교, ^# 피 <0.05). ㄴ PBS, DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN과 24시간 인큐베이션한 후 U87MG 세포의 아폽토시스. ㄷ PBS, DOX, DOX@TDN 및 DOX@Apt-TDN과 24시간 배양 후 U87MG 세포 주기의 유세포 분석 히스토그램(대조군과 비교, **p < 0.05; 대조군과 비교하여 ***p <0.01; DOX@Apt-TDN과 비교, ^# 피 <0.01)