교모세포종은 침습적 성장으로 가장 치명적인 원발성 뇌종양 중 하나입니다. 혈액-뇌 장벽(BBB)과 혈액-종양 장벽(BTB) 존재, 불충분한 약물 표적화로 교모세포종 치료 효과가 좋지 않습니다. DNA 사면체(TDN)는 약물 전달에 큰 잠재력을 보이며 교모세포종의 새로운 치료 전략이 될 수 있습니다. 본 연구에서는 TDN을 이용해 독소루비신(DOX)을 전달해 교모세포종 치료에 적용했습니다. 종양 세포의 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(PDGFRβ)를 인식하는 압타머 Gint4.T를 사용해 TDN을 변형(Apt-TDN)해 표적 약물 전달을 실현했습니다. TDN은 한 단계 합성으로 자기 조립되어 작은 크기(10nm)와 음전하를 보였습니다. 태아 소 혈청 테스트에서 약물 전달체로서의 안정성을 입증했습니다. Apt-TDN은 U87MG 세포에 효과적으로 섭취되었습니다. DOX와 DOX@TDN(TDN에 적재된 DOX) 대비 DOX@Apt-TDN(Gint4.T 변형 TDN에 적재된 DOX)은 U87MG 세포에 더 높은 초기 세포자멸사율, 더 높은 세포주기 정지, 더 강한 세포독성을 보였습니다. 결론적으로 DOX@Apt-TDN은 교모세포종 환자에게 유망한 임상 적용 가능성을 가진 새로운 치료법을 제공합니다.
교모세포종은 신경상피에서 유래한 종양으로 가장 흔한 두개내 악성 종양입니다. 전체 뇌종양의 약 1/3이 교모세포종이며, 원발성 악성 뇌종양의 약 4/5가 교모세포종입니다[1-4]. 현재 교모세포종 최적 치료는 수술적 절제와 수술 후 동시 화학방사선요법이지만, 불행히도 환자 예후는 여전히 좋지 않습니다. 기존 화학요법은 BBB와 BTB로 인한 약물 전달 어려움, 불충분한 약물 표적화로 좋은 결과를 보이지 않습니다. BBB는 거의 모든 거대분자(약물, 유전자 포함)의 뇌 실질 전달과 정상 기능을 막는 가장 중요한 요인입니다. BBB를 통과하지 못하는 약물은 관심 영역에서 효과적 치료 농도를 달성하기 위해 충분히 높은 용량으로 투여해야 합니다. 그러나 과다 약물은 심각한 전신 부작용과 비영향 조직 내 원치 않는 약물 축적을 초래할 수 있습니다. 또한 기존 항교모세포종 약물은 불충분한 표적화 능력을 가집니다[3,4].
나노입자는 가장 유망한 약물 전달 도구로 부상했습니다. 크기 이점으로 나노입자는 BBB를 통과해 항종양 효과를 발휘할 수 있습니다. Kafa 등은 ANG를 표적으로 하는 화학적으로 기능화된 다중벽 탄소나노튜브(f-MWNTs)를 설계하고 체내외 실험으로 BBB 통과 능력을 확인했습니다[5]. 그러나 이러한 나노소재는 몸 전체 다양한 장기에 분포하거나 중추신경계(CNS)에 진입해 신경독성을 유발할 수 있습니다[6].
DNA는 왓슨-크릭 염기 쌍 결합으로 조립을 정밀 제어할 수 있어 나노구조 구성에 이상적 소재입니다[7]. 현재까지 다수의 2D 및 3D DNA 나노구조가 설계되고 입증되었습니다[8-10]. 사면체 DNA 나노구조(TDN)는 생체적합성, 안정성, 풍부한 기능화 수정 부위, 낮은 면역원성으로 큰 주목을 받았습니다[11-13]. Turberfield 등은 한 단계 합성법으로 높은 수율의 DNA 사면체 나노구조를 합성했습니다[14]. Walsh 등은 핵산 프로브를 포함한 DNA 사면체가 트랜스펙션 시약 없이 포유류 세포에 진입할 수 있음을 발견했습니다[15]. Lee 등은 자기조립 사면체 나노입자가 체내 표적 siRNA 전달에 사용될 수 있음을 입증했습니다[16]. TDN은 분자 진단, 분자 전달, 표적 약물 치료에 우수한 응용 전망을 보입니다. 유방암[17] 등 다양한 장기 종양 연구에도 널리 사용됩니다. 마찬가지로 TDN은 신경계 질환 연구에도 사용됩니다. Tian 등은 DNA 사면체를 기반으로 안지오펩-2(ANG)로 변형해 ANG-TDN 나노프로브를 성공적으로 구축했으며, 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질 1(LRP-1)을 표적으로 표적 영상에 활용했습니다[18]. 연구에 따르면 ANG-TDN은 BBB를 통과할 수 있습니다. Ma 등은 사면체 DNA 나노구조가 트랜스펙션 제제 없이 신경줄기세포(NSC)에 진입해 신경줄기세포 이동, 증식, 분화를 촉진할 수 있음을 보였습니다[19,20], 신경 조직 복구와 재생에 큰 잠재력을 가집니다. 따라서 TDN의 교모세포종 치료 활용 가능성과 표적 능력 향상을 조사했습니다.
혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(PDGFRβ)는 세포 증식, 이동, 혈관신생에 관여하는 티로신 단백질 키나아제 패밀리의 중요한 구성원입니다. 여러 연구에서 PDGFβ가 혈관신생에서의 역할로 항종양 치료의 유망한 표적이 됨을 보였습니다[21,22]. 압타머는 기하급수적 풍부화에 의한 리간드 체계적 진화(SELEX)법으로 생성되는 짧은 단일가닥 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드입니다. 압타머는 항체와 유사하게 표적에 높은 친화도와 특이성을 가집니다[23]. 고유한 특성으로 압타머는 화학요법제, siRNA, 약물 탑재 나노입자의 표적 전달에 중요한 역할을 합니다. Gint4.T는 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머이자 PDGFRβ 특이적 길항제입니다[24]. Monaco 등은 Gint4.T 압타머가 BBB를 통과해 PDGFRβ를 특이적으로 인식할 수 있음을 제안했습니다[25]. Gint4.T 접합 고분자 나노입자(PNPs)는 교모세포종(GBM) 세포에 쉽게 섭취될 수 있습니다. 본 연구에서는 Gint4.T 압타머와 TDN을 결합한 새로운 약물 탑재 시스템을 보고합니다. DOX를 탑재한 Gint4.T 변형 TDN(Apt-TDN)(DOX@Apt-TDN)은 U87MG 세포에 대한 향상된 특이적 세포 섭취와 세포독성을 보였습니다.
모든 DNA 올리고뉴클레오티드와 2'F-Py RNA 올리고뉴클레오티드는 중국 상하이 Sangon Biotech에서 구입했으며, 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 표 1에 나열되어 있습니다. GelRed DNA 겔 염색 용액은 Sangon Biotech에서 구입했습니다. 태아 소 혈청(FBS)과 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)는 미국 뉴욕 Thermo Fisher에서 구입했습니다. 독소루비신(DOX)은 중국 충칭 Mengbio Technology에서 구입했습니다. U87MG 세포는 중국 상하이 상하이 생명과학원 세포은행에서 구입했습니다. DAPI는 중국 베이징 중산 골든 브리지 바이오테크에서 구입했습니다.
DNA 사면체 조립(표 1)을 위해 각 올리고뉴클레오티드(S1, S2, S3, S4) 2μL를 42μL TM 버퍼(10mM Tris-HCl, 5mM MgCl₂, pH=8)에 첨가했습니다. DNA 용액을 95°C에서 5분 가열한 후 바이오래드 PCR 기계(미국 캘리포니아)로 4°C에서 2분 냉각했습니다[26,27]. 최종 TDN 농도는 2μM입니다. TDN'은 S1을 S1'로 대체한 것 외에 동일한 방식으로 제조했습니다. Apt-TDN 합성을 위해 Gint4.T 압타머를 TDN과 등몰비로 혼합하고 37°C에서 60분 배양했습니다. 합성 전 압타머는 짧은 변성-재자연 단계를 거쳤습니다(85°C 5분, 2분 급속 냉각, 이후 10분간 37°C로 온도 상승)[25].
0.5× TEB 버퍼에서 3% 아가로스 겔을 100V로 30분 운행했습니다. 전기영동 장치 온도는 얼음 욕조에 장치를 넣어 0°C로 유지했습니다. 전기영동 전 GelRed를 아가로스 겔에 첨가해 DNA 가닥을 염색했습니다. 과정이 끝나면 바이오래드 형광 스캐너(미국 캘리포니아)로 겔 이미지를 촬영했습니다.
말번 제타사이저 ZS90(영국 말번)을 사용해 TDN의 수동적 크기와 제타 전위를 측정했습니다. 총 1mL TDN(100nM)을 동적 빛 산란(DLS) 분석에 사용했습니다.
TDN을 TM 버퍼(Tris-HCl 버퍼, MgCl₂ 함유)로 100nM 희석했습니다. 각 TDN 시료 10μL를 새로 쪼갠 운모에 떨어뜨리고 10분 배양했습니다. 이후 원자력 현미경(AFM, Agilent 5500, 미국) AC 모드로 이미징했습니다.
독소루비신을 탈염수에 녹여 500μM 저장 용액을 만들었습니다. 다양한 농도(1-20μM)의 독소루비신을 TDN(100nM) 또는 Apt-TDN(100nM)과 혼합해 실온(24-26°C)에서 6시간 반응시켰습니다. 혼합 용액을 12,000×g으로 10분 원심 분리해 약물 탑재 TDN을 얻었습니다. 상등액 50μL를 채취해 PBS와 1:1 비율로 혼합했습니다. 바리오스칸 LUX 마이크로플레이트 리더(미국 캘리포니아)로 독소루비신의 형광 강도(λex=480nm, λem=590nm)를 측정해 상등액 내 독소루비신 양을 결정했습니다[28]. 독소루비신 표준 곡선과 형광 강도로 TDN 내 탑재 독소루비신 농도를 계산했습니다. 또한 독소루비신을 TDN과 증가하는 몰비로 혼합했습니다.
TDN을 완전 배지와 혼합해 37°C에서 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24시간 배양했습니다. TDN 용액을 FBS와 1:1 비율로 혼합해 37°C에서 1, 3, 5, 7시간 배양했습니다. 배양 후 혼합물을 3% 아가로스 겔에서 전기영동했습니다.
TDN의 세포독성을 결정하기 위해 U87MG 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96웰 플레이트에 접종했습니다. 배양액을 제거하고 0-500nM TDN을 포함한 신선한 배지를 첨가해 하룻밤 배양 후 추가 24시간, 48시간 배양했습니다. 각 웰에 CCK-8 용액 10μL를 첨가하고 1시간 배양했습니다. 마이크로플레이트 리더로 450nm 흡광도를 측정했습니다.
DOX와 TDN의 세포 섭취를 형광 현미경(올림푸스, 일본 도쿄)으로 연구했습니다. U87MG 세포를 24웰 플레이트 커버슬립에 10% 열비활성화 FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유 배지로 접종하고 37°C, 5% CO₂ 가습 분위기에서 최소 1일 배양해 75% 이상 컨플루언스에 도달할 때까지 키웠습니다. 배양 후 배양액을 제거했습니다. 100nM Cy3-TDN과 Cy3-Apt-TDN을 포함한 완전 배지를 첨가해 3시간 배양했습니다. TDN과 Apt-TDN을 Cy3로 표지해 나노입자 세포 내 섭취를 검출했습니다. DOX 세포 섭취 평가를 위해 DOX(2μM), DOX@TDN(2μM), DOX@Apt-TDN(2μM)을 U87MG 세포에 첨가해 3시간 배양했습니다. 3시간 처리 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 암흑 고정하고 이후 DAPI로 5분 염색했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척 후 형광 현미경으로 관찰했습니다.
총 1×10⁶ U87MG 세포를 6웰 플레이트에 심었습니다. 하룻밤 배양 후 배양액을 제거하고 100nM Cy3-TDN, 100nM Cy3-Apt-TDN, 또는 100nM Cy3-Apt-TDN + 1μM free Apt를 포함한 배지를 첨가해 3시간 배양했습니다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 고정하고 유세포 분석으로 Cy3-양성 세포 비율을 분석했습니다.
DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN으로 24시간 처리 후 5×10⁵ 세포를 수집해 75% 얼음 에탄올로 하룻밤 고정했습니다. 이후 세포를 RNase와 요오드화 프로피듐으로 37°C 암흑에서 30분 배양했습니다. 유세포 분석으로 세포주기를 조사했습니다. 또한 다른 처리 후 세포를 Annexin V-FITC/DAPI로 염색해 초기 세포자멸사를 탐구했습니다.
세포 생존율을 결정하기 위해 U87MG 세포(5×10³)를 100μL 배지로 96웰 플레이트에 접종하고 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 배양했습니다. 배양액을 제거하고 DOX, DOX-TDN, DOX-Apt-TDN을 포함한 신선한 배지를 첨가했습니다. 24시간 배양 후 CCK-8 용액 10μL를 첨가하고 추가 1시간 배양했습니다. 마이크로플레이트 리더로 450nm 흡광도를 측정했습니다.
본 연구 모든 실험은 3회 반복 수행했으며, 모든 데이터는 평균±표준편차(mean±SD)로 제시했습니다. 통계 분석은 SPSS 24.0 프로그램(IBM, 미국)으로 수행했습니다. 유의성 검정은 학생 t-검정으로 수행했으며, P<0.05를 그룹 간 유의한 차이로 간주했습니다.
TDN은 네 올리고뉴클레오티드(표 1)에서 선행 보고[18,29]와 같이 단일 단계 합성으로 자기 조립되었습니다. 종양 표적 압타머 Gint4.T를 왓슨-크릭 염기 쌍 결합으로 TDN에 변형시켰습니다. DNA 사면체는 네 면을 가지며 각 면은 한 올리고뉴클레오티드로 형성됩니다. 따라서 네 올리고뉴클레오티드가 서로 혼성화돼 DNA 사면체를 형성합니다(그림 1a). 겔 전기영동 분석에서 4번과 5번 레인에 단일 뚜렷한 밴드가 나타나 TDN과 Apt-TDN이 성공적으로 구축됨을 시사합니다. Apt-TDN의 이동도가 TDN 대비 감소해 Gint4.T 압타머가 TDN을 성공적으로 변형시켰음을 보여줍니다.
a DNA 사면체와 Gint4.T-TDN 합성. 레인 1: S1; 레인 2: S1+S2; 레인 3: S1+S2+S3; 레인 4: S1+S2+S3+S4 (TDN); 레인 5: TDN 혼합 Apt-tail (Gint4.T); Apt-TDN. 레인 1은 핵산 염료가 단일가닥 DNA를 제대로 염색할 수 없어 보이지 않음. b AFM 이미지에서 TDN과 Apt-TDN 높이는 ~2nm. c 동적 빛 산란(DLS)으로 TDN과 Apt-TDN 입자 크기와 제타 전위 결정. TDN과 Apt-TDN 평균 입자 크기는 각각 10.10nm(A), 13.54nm(B). 평균 제타 전위는 각각 -5.69mV(C), -7.3mV(D)
TDN과 Apt-TDN 크기는 DLS와 AFM으로 결정했습니다. TDN과 Apt-TDN 입자 크기는 각각 10.1nm, 13.5nm로 Gint4.T 리간드 추가를 반영합니다(그림 1c (A), (B)). 수동적 직경은 물 분자를 포함하므로 이론적 크기보다 큽니다. AFM 이미지로 결정된 TDN과 Apt-TDN 높이는 모두 ~2nm로(그림 1b), 압타머 변형이 3D 구조를 변경하지 않음을 나타냅니다. TDN과 Apt-TDN 평균 제타 전위는 각각 -5.69mV(C), -7.3mV(D)입니다(그림 1c (C), (D)). 이 매개변수들로 TDN과 Apt-TDN이 성공적으로 조립됐음을 결론지었습니다.
겔 전기영동 분석에서 TDN은 37°C에서 완전 배지에 24시간 배양 시 온전하게 유지됐습니다(그림 2a (A)). 또한 태아 소 혈청 농도를 50%로 높여도 TDN은 최소 7시간 안정적으로 유지됐습니다(그림 2a (B)), 이는 선행 보고와 일치합니다[18,26]. 나노구조의 생물학적 안전성을 결정하기 위해 CCK-8 분석으로 다양한 농도 TDN 처리 후 U87MG 세포 생존율을 평가했습니다. 그림 2b에서 U87MG 세포를 0-500nM TDN과 24시간, 48시간 공배양 시 유의한 세포독성이 관찰되지 않았습니다. 따라서 DNA 나노입자는 안정적이고 생체안전한 약물 전달체로 사용될 수 있습니다.
a 겔 전기영동으로 TDN이 37°C 완전 배지에서 24시간 안정적임 확인(A); FBS 농도 50%로 증가 시 TDN 7시간 안정적(B). b U87MG 세포를 다양한 농도(10-500nM) TDN과 24시간, 48시간 공배양. CCK-8 분석에서 U87MG 세포 활성 영향 없음, TDN 생체안전성 입증
독소루비신은 DNA 이중가닥에 삽입될 수 있는 광범위 화학요법 약물입니다. 독소루비신 표준 곡선(그림 3a)을 계산한 후 독소루비신의 TDN 삽입을 조사했습니다. TDN과 Apt-TDN 내 삽입된 독소루비신 양은 독소루비신 농도 증가에 따라 점차 증가했습니다. 독소루비신 농도 14μM에서 TDN과 Apt-TDN 내 삽입 독소루비신 농도가 각각 5.5μM, 6.0μM로 정점에 달한 후 정체되었습니다(그림 3b), 이는 DNA 가닥이 완전히 포화됐음을 의미합니다. 한편 독소루비신을 TDN과 증가하는 몰비로 혼합했습니다. 독소루비신 형광 스펙트럼을 스캔해 분석했습니다. 그림 3c에서 독소루비신 몰비 0.05에서 형광 스펙트럼이 소멸되었습니다. 이 결과로 단일 DNA 사면체에 약 55개 독소루비신 분자가, 단일 압타머 변형 DNA 사면체에 약 60개 독소루비신 분자가 포함됨을 결론지었습니다.
a PBS 버퍼에서 DOX 농도 표준 곡선; λex=480nm, λem=590nm. TDN과 Apt-TDN이 운반하는 DOX 양. b DOX가 TDN과 Apt-TDN 이중가닥 DNA에 삽입. DOX 농도 14μM 도달 시 TDN과 Apt-TDN 내 삽입 DOX 농도 각각 5.5μM, 6.0μM로 피크, 단일 DNA 사면체당 55개 DOX 분자, 단일 압타머 변형 DNA 사면체당 60개 DOX 분자 탑재. c 상등액 DOX 형광 스펙트럼. DOX를 TDN과 증가하는 몰비(위에서 아래로 0, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05)로 혼합. 몰비 1:20에서 형광 소멸
DNA는 음전하 거대분자로 음전하 세포막 진입이 어렵습니다. 일반적으로 개별 DNA 분자는 트랜스펙션 시약 도움을 받아야 세포에 진입합니다. 여기서는 TDN과 Apt-TDN을 Cy3로 표지해 나노입자 세포 내 섭취를 모니터링했습니다. U87MG 세포와 3시간 배양 후 세포질에 붉은 Cy3 형광 신호가 나타나 TDN이 트랜스펙션 시약 없이 세포막에 결합해 세포 내로 섭취됐음을 나타냅니다(그림 4a). Apt-TDN은 더 강한 붉은 형광을 보여 Gint4.T 압타머 존재가 U87MG 세포에 의한 DNA 사면체 섭취를 유의하게 증가시킴을 시사합니다. 그러나 자유 압타머 첨가 시 Cy3 형광이 TDN 단독 수준으로 감소했습니다. 자유 압타머에 의한 경쟁적 억제로 TDN 상 압타머가 TDN 섭취를 촉진할 수 없음을 추론했습니다. 이 경쟁적 억제로 Apt-TDN이 U87MG 세포를 표적할 수 있음을 입증했습니다. 유세포 분석으로 Apt-TDN 그룹에서 Cy3-양성 U87MG 세포 비율이 TDN 그룹보다 높음을 추가 입증했습니다. 자유 Apt는 Apt-TDN 그룹의 Cy3-양성 U87MG 세포 비율을 감소시켰습니다(그림 4b).
a U87MG 세포의 TDN과 Apt-TDN(TDN-Gint4.T) 섭취. TDN은 트랜스펙션 시약 없이 직접 U87MG 세포 진입, Apt-TDN(압타머 Gint4.T 연결) 섭취 유의하게 증가, 자유 Apt(Gint4.T)에 의한 경쟁적 억제로 압타머 Gint4.T가 세포 표적화에 중요한 역할 함 입증. 스케일바 50μm. b 3시간 배양 후 TDN, Apt-TDN, Apt-TDN+Apt 세포 내 섭취 유세포 분석 곡선
독소루비신 고유 형광 스펙트럼으로 약물 섭취 효율을 평가했습니다. 3시간 처리 후 세포 내 독소루비신을 형광 현미경으로 이미징했습니다(그림 5a). 자유 독소루비신은 U87MG 세포에 진입해 핵에 위치했습니다. DOX@TDN 첨가 시 형광이 자유 독소루비신보다 강해 DNA 나노입자가 독소루비신 세포 섭취를 향상시킴을 시사합니다. DOX@Apt-TDN 첨가 시 핵 내 붉은 신호가 DOX@TDN 첨가 세포보다 더 강했습니다. 세포 내 DOX 섭취 반정량 분석으로 Apt-TDN이 단일 약물 대비 세포 내 DOX 섭취를 2배 이상 증가시킴을 확인했습니다. 이는 Gin4.T가 수용체에 특이적으로 결합해 더 많은 나노입자가 세포에 진입하기 때문으로 추론됩니다. 리소좀에서 소화 후 독소루비신은 세포질로 방출돼 핵에서 기능합니다.
a DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 세포 섭취. 압타머 Gint4.T 변형으로 Apt-TDN이 TDN보다 더 많은 독소루비신 U87MG 세포 전달. 또한 TDN이 단일 약물보다 더 많은 약물 세포 전달. 스케일바 50μm. b PBS, DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 처리 시 독소루비신 형광 강도 반정량 분석(대조군 대비: *p<0.05, **p<0.01)
세포독성 연구를 위해 U87MG 세포 세 그룹을 다른 농도 독소루비신으로 처리했습니다(그림 6a). DOX 처리 IC₅₀ 값은 13.39μM, DOX@TDN 처리 7.826μM, DOX@Apt-TDN 처리 4.205μM였습니다. 세 처리 중 DOX@Apt-TDN이 24시간 후 가장 높은 세포독성을 보여 Apt-TDN의 U87MG 세포 특이성을 입증했습니다. 24시간 후 DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 그룹 세포를 수집해 초기 세포자멸사 탐구. 데이터는 DOX@Apt-TDN 그룹에서 초기 세포자멸사율이 다른 두 그룹보다 높음을 보여줍니다(그림 6b). 또한 DOX-Apt-TDN 그룹에서 G0/G1기 세포 비율이 DOX, DOX-TDN 그룹 대비 증가(p<0.01), S기 세포 비율 감소(p<0.01)했습니다(그림 6c). G2기 세포 비율은 변화 없음(데이터 미표시).
a 다양한 농도에서 DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 세포독성. U87MG 세포 억제율은 DOX 농도 증가에 따라 유의하게 증가, DOX@TDN과 DOX@Apt-TDN 그룹이 DOX 그룹 대비 유의하게 높은 세포독성. DOX@Apt-TDN 그룹 억제율도 DOX@TDN 그룹 대비 유의하게 높음(DOX 대비: **p<0.05, ***p<0.01; DOX@Apt-TDN 대비: #p<0.05). b PBS, DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 24시간 배양 후 U87MG 세포 세포자멸사. c PBS, DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 24시간 배양 후 U87MG 세포주기 유세포 분석 히스토그램(대조군 대비: **p<0.05, ***p<0.01; DOX@Apt-TDN 대비: #p<0.01)
체외 또는 체내 실험 여부와 상관없이 약물과 전달체의 안정성 결정이 필수적입니다. TDN 조립 후 체외 안정성을 먼저 결정했습니다. 본 연구에서 DNA 나노입자의 3D 구조가 효소 결합을 억제해 혈청 내 안정성을 향상시킬 수 있음을 보였습니다. 관련 나노구조의 생물학적 안전성은 응용의 가장 중요한 요건입니다. U87MG 세포를 다양한 농도 TDN과 24시간, 48시간 공배양 시 유의한 세포독성이 관찰되지 않았습니다. 본 연구 사용 DNA 서열 중 어느 것도 유전 정보를 인코딩하지 않으며, 세포독성 테스트에서 부작용 보고되지 않았습니다. 따라서 TDN은 안전하고 안정적인 약물 전달체로 사용될 수 있습니다.
압타머 변형 나노구조의 표적 효율은 암세포로의 선택적 약물 전달에 필수적입니다. 항체와 달리 압타머는 화학적으로 안정하고 저렴하며 대량 생산 가능합니다. 또한 다른 소재와 달리 압타머는 염기 상보성 원리로 DNA 사면체에 쉽게 결합할 수 있습니다. 따라서 압타머와 DNA 사면체 결합은 표적 약물 전달과 차세대 치료의 기반을 마련합니다. 우리 결과는 TDN이 트랜스펙션 시약 없이 세포에 진입할 수 있음을 보여주며, 이는 Walsh 등과 Ma 등의 결과와 유사합니다[15,19]. TDN 대비 Apt-TDN의 U87MG 세포 섭취가 유의하게 증가했습니다. 자유 압타머 첨가 후 이 증가가 사라졌습니다. 이는 Gint4.T가 PDGFRβ 특이적 길항제임을 시사합니다[25]. 본 연구는 Gint4.T 압타머가 교모세포종 세포 표면의 높은 PDGFRβ 발현으로 U87MG 세포를 표적할 수 있음을 입증했습니다. Camorani 등은 Gint4.T 압타머가 PDGFRβ 세포외 도메인과 특이적으로 상호작용해 종양 세포를 표적할 수 있음을 보였습니다[24]. Gint4.T 압타머 표적화 이점은 체외 연구로 어느 정도 입증됐으나, 추가 체내 실험으로 확인 필요합니다. 본 연구는 DOX@Apt-TDN이 DOX나 DOX@TDN보다 더 강한 세포독성을 가짐도 확인했습니다. 이는 두 가지 요인에서 기인할 가능성이 높습니다. 첫째, Gint4.T 압타머가 PDGFR 세포외 도메인에 특이적으로 결합해 종양 세포 증식 차단과 성장 억제[24]. 이는 우리 실험 결과와 일치합니다. 대조군 대비 DOX, DOX@TDN, DOX@Apt-TDN 처리 후 U87MG 세포주기 변화에서 G0/G1기 종양 세포 유의 증가, S기 세포 감소, G0/G1기 종양 세포 차단으로 U87MG 세포주기 억제와 증식 억제 입증. DOX, DOX@TDN 그룹 대비 DOX@Apt-TDN 그룹이 U87MG 세포 증식 억제 능력이 유의하게 강함. 둘째, Gint4.T가 종양 세포에 특이적으로 결합해 DOX@Apt-TDN 복합체의 세포 표적화 강화. 따라서 약물 표적화 효율 증가와 항종양 약물 전신 투여 용량 감소를 통해 전신 부작용 예방 가능.
Gint4.T 변형은 교모세포종 세포에 다량 발현된 PDGFRβ를 표적해 교모세포종 치료에서 TDN의 특이성과 효율을 증가시켰습니다. 또한 Apt-TDN에 탑재 시 DOX의 항교모세포종 효과를 유의하게 촉진했습니다. 따라서 DOX@Apt-TDN은 환자 대상 교모세포종 유망 치료 전략이 될 수 있습니다. 본 연구 한계는 체외 검증만 수행됐다는 점입니다. 향후 연구에서 동물 모델로 추가 탐구 예정입니다.
관련 데이터는 논문 내에 포함되어 있습니다.
나노물질
워크셀 구축 시 고려사항 예산, 레이아웃, 필요 애플리케이션, 기계 종류, 기능 강화 옵션 등 다단계 검토 필요. 예산: 신품 vs 중고 로봇 신품은 최신 기능·깔끔함 장점. 중고 로봇은 신품 절반 가격에 동등 성능 발휘. 예산 제한 시 경영진 설득 핵심 포인트. 생산 라인 재고찰(Reimagine) 필요 중고 로봇 용도 결정 후 전체 생산 라인 재검토. 수작업 공정을 로봇 수행 방식으로 변환(조립 라인 완전 뒤집기 포함). 성공 시 시스템 속도 이점 극대화. 워크셀 구축 복잡성 → 로봇 통합 업체 활용이 최선 로봇웍스: A
자동화 업그레이드는 제조업체가 두려워할 일이 아닙니다. 오히려 생산성을 한 단계 끌어올릴 기회로 삼아야 합니다. 모토만 아크월드 1000을 아크 용접 애플리케이션에 도입하면 공간과 시간을 동시에 절약할 수 있습니다. 공간 절약형 셀 설계 모토만 아크월드 1000은 1~2대의 로봇, 컨트롤러, 용접 패키지, 포지셔너 테이블, 안전 패키지로 구성된 공간 절약형 셀입니다. 장비 베이스를 이동시켜 기술자가 유지보수 시 쉽게 접근할 수 있으며, 공통 장비 베이스 설계에 포크리프트 포켓과 사전 조립된 펜스가 포함되어 빠른 설치가 가능합니다.
