새로운 GAL-GNR-siBRAF 나노시스템을 사용한 표적 유전자 억제 BRAF 시너지 광열 효과로 간암 세포 성장 억제
초록
간암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. RAF 키나제 억제제는 간세포 암종(HCC)의 치료에 효과적입니다. 따라서 BRAF/MEK/ERK 경로의 억제는 새로운 HCC 요법을 위한 새로운 치료 전략이 되었습니다. 그러나 종양에 대한 표적화된 특정 전달 시스템은 여전히 임상 적용에 중요한 장애물입니다. 갈락토스(GAL)는 간암 세포에서 높게 발현되는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)를 표적으로 할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 세 부분으로 구성된 새로운 다기능 나노물질 GAL-GNR-siBRAF를 설계했습니다. 간암 표적 부분인 GAL, 근적외선에서 광열 기능을 제공하는 GNR(골든 나노로드), siRNA BRAF(siBRAF ). 나노운반체 GAL-GNR-siBRAF는 높은 siRNA 로딩 능력을 보였고 혈청에서 siRNA의 분해를 억제하였다. 네이키드 금 나노로드와 비교하여 GAL-GNR-siBRAF는 생물학적 독성이 낮고 유전자 억제 효능이 더 높습니다. GAL-GNR-siBRAF를 사용한 치료는 BRAF의 발현을 유의하게 하향조절하고 간암 세포의 증식, 이동 및 침윤을 손상시켰다. 더욱이, GAL-GNR-siBRAF에 의한 조합 광열 효과와 BRAF 녹다운은 효과적으로 종양 세포 사멸을 야기했습니다. 따라서 우리 연구는 간암 치료를 위한 새로운 유형의 표적화된 다기능 나노물질 GAL-GNR-siBRAF를 개발했으며 이는 새로운 임상 치료 방법 개발에 대한 아이디어를 제공합니다.
소개
간세포암종(HCC)은 전 세계의 주요 건강 문제입니다[1]. 이는 세계에서 6번째로 흔한 암이며, 암 관련 사망의 3번째 주요 원인입니다[2, 3]. 대부분의 HCC 사례는 동아시아와 사하라 사막 이남의 아프리카에서 발생합니다. 그러나 프랑스, 영국, 일본, 미국 등 일부 선진국에서는 발병률이 증가하고 있다[4]. 초기 HCC의 표준 치료법은 종양의 외과적 절제입니다. 수술 후 5년 생존율은 89~93%입니다[5]. 불행히도, 간세포암종 환자의 적은 비율(약 20-30%)만이 초기 단계에서 진단됩니다. 대부분의 간세포암종 환자(> 70%)는 고급 장면에서 발견되며 외과적 절제를 받을 수 없습니다. 다른 치료 옵션에는 간 이식, 경동맥 동맥 화학 색전술(TACE) 및 전신 화학 요법이 있습니다[6]. 그러나 간 이식은 공급에 의해 제한되며 불완전한 TACE 색전술은 전신 화학 요법의 심각한 부작용 및 불량한 전반적인 예후와 함께 치료 실패로 이어질 수 있습니다. 따라서 간세포암종에 대한 새로운 치료법은 임상적으로 매우 까다롭다[7].
RAS/RAF 신호 전달 경로는 간암 발병에 필수적인 역할을 하며, BRAF는 이 경로에서 필수적인 암 관련 유전자 중 하나입니다. 이러한 유전자의 유전적 변형은 종종 두 가지 연쇄적 장애를 초래합니다. RAS/RAF 신호 전달 경로의 비정상적인 활성화는 암 환자의 나쁜 예후와 관련이 있습니다[8]. BRAF는 RAF 계열에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며, RAS/RAF 경로를 표적으로 하는 것은 HCC 치료를 위한 새로운 치료 전략입니다[8,9,10]. RAF kinase inhibitor인 sorafenib이 간세포암종 치료에 유용한 것으로 밝혀지면서 BRAF 돌연변이가 간세포암종 치료의 선호되는 표적이 되었다[8]. 보다 구체적으로, BRAF 돌연변이는 아시아, 유럽 및 미국에서 HCC 치료에서 RAF kinase inhibitor인 sorafenib의 임상 개발이 발견됨에 따라 진행성 HCC 치료의 바람직한 표적이 되었다[11]. 위약에 비해 소라페닙은 전체 생존을 증가시켜 진행성 간세포암종 환자의 전체 생존 중앙값을 연장시켰다[12,13,14]. 그러나 소라페닙은 종양 표적화 능력이 낮아 고혈압, 탈모, 메스꺼움 등의 부작용을 유발할 수 있다[15]. 높은 특이도로 간암을 표적으로 하고 RAF를 차단하는 약물은 더 연구되어야 합니다.
간 갈락토스 수용체로도 알려진 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)는 간세포의 정현파 표면에서 발현되는 C형 렉틴입니다[16]. ASGPR은 말단 갈락토오스 잔기가 있는 물질의 결합, 내재화 및 제거에 중요한 역할을 하기 때문에 간 나노구조의 필수 표적으로 간주된다[17]. 여러 단당류(갈락토오스, 만노오스, 유당, N-아세틸갈락토사민, 시알산)는 다양한 정도로 ASGPR과 상호작용하는 것으로 보고되었으며, 갈락토오스는 ASGPR에 대해 더 높은 친화도를 보였다[18]. ASGPR은 간 실질 세포의 표면에 강하게 노출되기 때문에[19], 수용체는 갈락토오스 및 갈락토오스 전구약물 또는 간을 표적으로 하는 전달 시스템에 대해 강한 친화력을 가지고 있습니다. 갈락토오스 나노입자[20], 갈락토오스 미셀[21], 갈락토오스 리포솜[22]은 간세포 카르시노이드 세포를 특이적으로 표적으로 하는 간 표적 약물 시스템으로 확인되었습니다.
금 나노막대(GNR)는 막대 모양의 금 나노입자로 나노운반체로서 상당한 이점이 있다[23]. 금나노막대(GNR)는 생체적합성이 뛰어나 siRNA의 안정적인 전달에 사용될 수 있다[24]. 그들은 특정 종양 표적 어댑터의 유연한 변형을 허용하는 큰 비표면적을 가지고 있습니다[25]; LSPR(Localized Surface Plasmon Resonance)은 근적외선 조사에서 높은 광열 변환 효율을 가지며 우수한 광열 항종양 물질이 되었다[26]. GNR(Gold nanorod)의 종횡비를 조정하여 최대 광열 효율을 얻을 수 있습니다. 금 나노 입자의 시험관 내 및 생체 내 독성은 크기, 표면 전하 및 표면 코팅에 따라 다릅니다[27]. 그러나 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)는 금 나노막대 합성에 필수적인 활성제이며 명백한 세포독성을 갖고 생물학적 적용을 제한합니다[28].
RNA 간섭(RNAi)은 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 표적 유전자를 효과적으로 녹아웃시키거나 침묵시키기 때문에 암 치료에 대한 유망한 접근 방식이 되었습니다[29]. 최근 siRNA 분자는 인간 실험 단계에 진입했으며 다중 돌연변이 유전자 암 및 종양을 치료하는 유망한 방법으로 간주됩니다[30]. 그러나 siRNA의 적용은 여전히 혈청 불안정성(세포외 환경에서 뉴클레아제에 의한 분해) 및 표적 외 효과와 같은 엄청난 문제에 직면해 있습니다[31]. 또한 siRNA는 음전하를 띠기 때문에 음전하를 띤 세포막에 결합하는 것을 방지합니다[32]. 이러한 특성 때문에 siRNA 자체가 세포에 직접 전달될 가능성은 거의 없습니다. siRNA의 안정성은 siRNA를 화학적으로 변형하거나 siRNA 로더를 보호 캐리어 물질에 삽입하여 향상시킬 수 있습니다[33].
이 연구에서 우리는 다기능 나노운반체 GAL-GNR-siBRAF를 새로 구성했습니다. 이 시스템은 광학적 발열 능력을 가진 금 나노막대를 내부 코어로 사용하고 외부에서 변형된 GAL(d-갈락토오스)을 간 종양에 특이적으로 표적화한다. 이 시스템은 금 나노막대 표면에서 CTAB의 생물학적 독성을 감소시켰고 높은 siRNA 로딩 능력을 보여 간암에서 BRAF 유전자를 효과적으로 침묵시키는데 사용될 수 있다. GAL-GNR-siBRAF의 적용은 간암 세포의 증식, 침습 및 이동을 유의하게 약화시켰습니다. 또한, GAL-GNR-siBRAF는 BRAF의 유전자 억제와 광열 효과를 동시에 유도하여 종양 세포의 사멸 능력에서 시너지 효과를 달성함으로써 간암 임상 치료 개발에 대한 새로운 사고 방식을 제시했습니다.
자료 및 방법
세포주
마우스 간세포 암종 세포주 Hepa1-6은 중국 과학 아카데미의 줄기 세포 은행에서 구입했습니다. 세포를 37°C, 5% CO2에서 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지(Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 배양했습니다. .
BRAF siRNA의 합성
BRAF 유전자를 표적으로 하는 siRNA의 서열은 5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3'이며 Dharmacon, Inc.(Lafayette, CO, USA)에 의해 합성되었습니다. 시판되는 표적 루시퍼라제 유전자 siGL2를 음성 대조군 siRNA로 사용했습니다.
CTAB-GNR의 합성
수용성 금 나노로드는 종자 매개 성장 경로를 사용하여 합성되었습니다[34]. 종자 용액은 다음과 같이 제조되었습니다:1 mL의 cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)(0.2 M)(Sinopharm)와 1 mL의 HAuCl<하위>4 (0.5 mM) (Sinopharm). 용액을 28°C에서 교반하고 완전히 혼합하고 0.12 mL의 차가운 NaBH4를 첨가했습니다. (0.01 M) (Sinopharm) 수득된 종자 용액이 갈색으로 변하고 예비로 남아 있을 때까지. 성장 용액은 다음과 같이 합성되었습니다:50 mL의 CTAB(0.2 M) 및 50 mL의 HAuCl4 (1 mM), 2.5 mL AgNO3 (4 mM)(Sinopharm)을 28℃에서 가볍게 혼합하였다. 충분히 약한 혼합 후, 용액의 색이 암황색에서 무색으로 변할 때 670μL의 아스코르브산(0.079μL)을 첨가하였다. 120 마이크로리터의 시드 용액을 28 °C에서 부드럽게 교반하면서 첨가하고 색상은 보라색에서 보라색-검정색으로 점차 투명해졌습니다. 일정한 온도에서 24시간 동안 교반한 후 용액을 10분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하여 추가 CTAB를 제거하고 향후 사용을 위해 GNR 분말로 진공 동결 건조했습니다.
MUA-PEI 및 GAL-PEI-MUA의 합성
메르캅토운데칸산(MUA; 654 mg)을 30 mL의 클로로포름(CHCl3 ) 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC) 100mmol 및 N-히드록시숙신이미드(NHS) 100mmol과 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션했습니다. 다음으로, 100 mmol 폴리에틸렌이민(PEI)을 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 24시간 반응 후, 동일한 부피의 탈이온수를 사용하여 수용성 PEI-MUA를 추출하였다. 동일한 방법을 사용하여 수용액에서 d-갈락토스의 활성화를 완료했습니다. 그 다음, 상기 수용성 PEI-MUA 용액에 과량의 활성화된 d-갈락토스(500 mmol)를 첨가하고, 실온에서 24시간 충분히 반응시켜 수용성 GAL-PEI-MUA를 얻었다. 복잡합니다.
GAL-PEI-MUA-GNR(GAL-GNR) 및 PEI-MUA-GNR(PEI-GNR)의 합성
동결 건조된 CTAB-GNR 분말(10 mg)을 10 mL의 수용성 PEI-MUA 또는 GAL-PEI-MUA 복합체에 현탁했습니다. CTAB는 실온에서 24시간 동안 교반했을 때 Au-S 결합으로 대체되었습니다. 용액을 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 과량의 상층액을 제거하고 침전물을 증류수로 3회 세척하였다. PEI-GNR 또는 GAL-GNR 분말을 동결건조하여 칭량하여 non-ribozyme water에 녹인 후 다기능 효소 분석기(Spectra Max M5e, MD, USA)로 혈장 공명 효과를 관찰하였다.
투과 전자 현미경
GNR 또는 GAL-GNR을 증류수에 현탁시키고, 재현탁액을 구리 그리드에 놓았다. 구리 메쉬의 샘플을 공기 중에서 30분 동안 완전히 건조시킨 후, 구리 메쉬를 투과 전자 현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 이미지화했습니다.
자외선 가시 분석
GNR, PEI-GNR 또는 GAL-GNR은 증류수에 현탁되었습니다. 600 ~ 900 nm 파장 범위의 나노 물질의 표면 플라즈몬 공명 효과를 다기능 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M5e, MD, USA)를 사용하여 조사했습니다.
제타 전위 및 유체역학적 직경 분석
GNR, PEI-GNR 또는 GAL-GNR을 증류수에 현탁시킨 후, Zetasizer Nano ZS에서 나노물질의 제타 전위 및 유체역학적 직경을 측정했습니다.
핵자기 공명 분석
GAL-GNR 동결건조 분말을 중수(99%, Sigma)에 녹여 균질한 현탁액을 만든 후, 현탁액을 NMR 시료 튜브에 옮겼다. GAL-GNR의 조성은 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)(Bruker, 600mhz, Germany)에 의해 결정되었습니다.
겔 이동 분석
GAL-GNR과 siBRAF는 질량비(0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1)에 따라 혼합하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, DNA 로딩 완충액을 혼합물에 첨가하였다. 모든 샘플을 0.01% Goldview(Bioshop, USA)가 포함된 2% 아가로스 젤에 첨가한 다음 90 V에서 30분 동안 전기영동했습니다. siBRAF 랩핑 정도는 젤 이미징 시스템에서 시각화되었습니다.
혈청 내 siRNA의 안정성
GAL-GNR-siBRAF(6:1)의 혼합물을 신선한 쥐 혈청에서 37°C에서 각각 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h 및 48 h 동안 배양했습니다. 네이키드 siBRAF와 신선한 뮤린 혈청 그룹은 동일한 조건에서 처리되었습니다. 동일한 부피의 2% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 GAL-GNR-siBRAF 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, DNA 로딩 완충액을 첨가하고, 모든 샘플을 2% 아가로스 겔(0.02% Goldview(Bioshop, USA) 함유)에 로딩하고 90 V에서 30분 동안 전기영동하였다. siBRAF의 스트립 밝기는 젤 이미징 시스템에서 시각화되었습니다.
GAL-GNR-siBRAF의 경쟁 억제 분석
2 × 10
5
Hepa1-6 세포를 12웰 마이크로플레이트에서 밤새 배양하였다. 그런 다음, 세포를 12시간 동안 Lactobionic acid로 전처리한 다음 GAL-GNR--siBRAF(Cy3 표지)로 30분 동안 형질감염시켰다. 세포내 형광 강도는 형광현미경으로 측정하였다(스케일바 =200 μm).
GAL-GNR-siBRAF의 간암 표적 전달 능력
cy3로 표지된 siBRAF 1마이크로그램을 PEI-GNR(30 μg/mL), GAL-GNR(30 μg/mL)과 함께 실온에서 20분 동안 배양한 다음 Hepa1-6 세포의 배지에 첨가했습니다. 30분 동안 배양한 후, 세포를 50% FBS로 3회 세척하고, 형광현미경으로 세포내의 형광 강도를 측정하였다.
광열 효과
20, 40, 60, 80, 100 μg의 GAL-GNR과 100 μg의 GNR 동결건조 분말을 1 mL의 증류수에 완전히 녹였습니다. 용액을 24-well plate에 넣고 803 nm 근적외선 레이저 소스(2 W/cm
2
) 15 분 동안. 각 그룹의 온도는 적외선 온도계로 처음 5분 동안은 0.5분 간격으로 기록하고, 그 다음에는 1분 간격으로 온도를 표시하였다.
MTT 분석
200마이크로리터의 세포(3.5 × 10
4
/mL)를 96웰 마이크로플레이트에서 24시간 동안 배양한 다음 다른 농도의 GNR 또는 GAL-GNR(0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120μg/mL)로 배양했습니다. 배양 24시간 또는 48시간 후, 20μL MTT를 배양 시스템에 첨가하고 추가로 4시간 동안 배양했습니다. 보라색 결정을 150 μL DMSO에 녹인 후 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M5e, MD, USA)에서 650 nm 기준을 사용하여 490 nm에서 분광광도 분석을 수행했습니다.
Calcein-AM 및 PI 염색 테스트
Hepa1-6 세포(1.5 × 10
5
)를 12웰 플레이트에 밤새 보관하고 PBS, 레이저, GAL-GNR-siBRAF(30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2(30 μg/mL:1 μg) + 레이저 또는 GAL로 처리했습니다. -GNR-siBRAF(30 μg/mL:1 μg) + 레이저 4 h 후 근적외선 조사(808 nm, 2 W/cm
2
) 15 분 동안. GAL-GNR의 세포독성은 calcein-AM(살아있는 세포) 및 PI(죽은 세포) 염색 실험에 의해 검출되었습니다. 칼세인-AM의 녹색형광과 PI의 적색형광을 형광현미경으로 촬영하였다.
실시간 정량적 PCR
Trizol(Trizol 시약, Invitrogen)을 사용하여 전체 세포 RNA를 추출하고 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용했습니다. Q-PCR은 Stratagene Mx3000P qRT-PCR 시스템(Agilent Technologies, Lexington, MA, USA)에서 유전자 특이적 정방향 및 역방향 프라이머(각각 0.5 μL × 10 μM)를 사용하여 수행되었습니다. 제조사의 계획에 따라 SYBR green PCR MasterMix(Life Technologies)를 사용했습니다. 하우스키핑 유전자 β-액틴을 내부 참조로 사용했습니다. 프라이머 서열은 β-액틴:5'AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3'(정방향) 및 5'ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'(역방향); BRAF:5'-CAATTTGCTGGGACACGGACAT-3'(앞으로) 및 5'-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3'(뒤로). 유전자 발현의 차이를 계산하여 2
−∆∆Ct
로 표시하였다. 방법.
서부 얼룩
Hepa1-6 세포의 총 단백질은 RIPA 완충액(Cell signaling, Pickering, Ontario, Canada)에 의해 얻어지고 bicinchoninic acid(BCA)에 의해 정량화되었습니다. 단백질을 12% SDS-PAGE에서 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)로 옮겼습니다. 하우스키핑 유전자 β-액틴은 BRAF 단백질 발현을 검출하기 위한 내부 참조로 사용되었습니다. ECL chemiluminescence로 protein band와 target protein의 내부 reference를 검출하였다.
스크래치 테스트
형질감염된 Hepa1-6(1.7 × 10
5
/mL) 세포를 12-웰 플레이트에 밤새 접종하였다. 플레이트에 완전히 부착된 세포를 10μL 피펫 팁으로 긁었습니다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 2% FBS를 함유하는 배지로 교체하였다. 상처 선의 평균은 0, 24 및 48시간 후 현미경으로 관찰되었습니다. 각 스크래치 테스트는 세 번 수행되었습니다.
이주 및 침입에 대한 Transwell 분석
8마이크로미터 트랜스웰 챔버(Corning Life Science)를 사용하여 세포 이동 및 침입을 평가했습니다. 200 μL의 무혈청 배지에 현탁된 Hepa1-6을 1.7 × 10
5
의 밀도로 상부 챔버에 첨가했습니다. mL 세포/웰, 그 다음 12% FBS를 함유하는 500 μL의 배지를 하부 챔버에 첨가하였다. 24~48시간 동안 배양한 후 세포를 4% paraformaldehyde 용액으로 30분 동안 고정한 후 1% crystal violet 용액으로 30분 동안 염색하였다. 마지막으로 세포의 사진을 찍고 도립현미경으로 계수하였다. 세포 침입 분석의 경우 세포 침입 실험에는 ECM 겔 코팅이 필요하며 나머지 단계는 일관됩니다.
통계
모든 실험은 삼중으로 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± SD 및 학생의 t로 표현되었습니다. 테스트(양측)를 통해 두 방법 간의 차이를 확인합니다. 일원 ANOVA 테스트는 여러 그룹의 비교에 사용되었습니다. 데이터는 p에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. <0.05 (*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001).
<섹션 데이터-제목="결과">
결과
나노캐리어 GAL-GNR-siBRAF의 합성 및 특성화
우리는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 간 세포에 전달하고 금 나노막대의 광열 효과를 동시에 유지할 수 있는 새로운 나노운반체 GAL-GNR을 설계했습니다. GAL-GNR의 합성 절차는 Scheme 1에 나와 있습니다. 이 간 표적 시스템은 세 가지 기능적 구성 요소를 포함합니다. 첫째, GAL-GNR의 기본 부분은 GNR 골격으로, TEM 이미지(Fig. 1a)에서 볼 수 있듯이 길이 약 30 nm, 지름 10 nm이며, 화학적으로 결합된 GNR(GAL-GNR)에서는 유의한 차이를 보이지 않았다. 치수 변화와 여전히 잘 분산성을 보유하고 있습니다(그림 1b). 입자크기 데이터는 GNR의 평균크기가 30.23 nm로 전자현미경 결과와 일치하였고, GAL-GNR(50 nm)과 PEI-GNR(42.35 nm)의 크기가 GNR보다 컸기 때문에 GAL과 PEI의 접합은 입자 사이의 수화를 증가시켰다(그림 1c). 두 번째로, GNR 표면의 생물학적 독성 CTAB는 음으로 하전된 siRNA로 로드될 수 있는 양으로 하전된 MUA-PEI로 대체되었습니다. 제타 전위 측정은 GNR이 PEI 또는 GAL-PEI로 각각 수정될 때 GNR의 표면 전하가 35.6에서 42.7 mV 또는 41.8 mV로 증가함을 보여주었으며, 이는 GAL-GNR이 siRNA에 결합하는 강력한 능력을 보유함을 나타냅니다(그림 1d). 셋째, GAL을 가이드 분자로 적용하여 간세포 암종의 특정 귀환에 사용할 수 있는 GNR 나노운반체를 접합했습니다. UV-Vis 흡수 분광법은 변형된 GNR의 구조를 미리 감지하기 위해 사용되었습니다. 수정되지 않은 GNR의 초기 흡수 스펙트럼 파장은 763 nm였습니다. MUA-PEI 수정으로 초기에 파장에서 7 nm의 이동이 관찰되었고, GAL을 사용한 GNR 수정이 성공적일 때 합성이 끝날 때 8 nm의 또 다른 이동이 관찰되었습니다(그림 1e). 나노 시스템에서 GAL을 확인하기 위해 NMR 이미지를 사용하여 화학 그룹을 분석했습니다. 그 결과 갈락토스의 H 신호는 NMR 수소 스펙트럼의 GAL-GNR 스펙트럼에서만 발견되었으며 δ:3.60, 3.65, 3.70, 3.78, 3.90, 4.53이었다. NMR 스펙트럼은 GAL이 GNR 표면에 성공적으로 접합된 GAL의 화학 구조를 확인했습니다(그림 1f).
<그림>
GAL-GNR 합성 절차. 아 MUA-PEI의 합성 과정. ㄴ d-갈락토스의 활성화 및 MUA-PEI와의 화학 반응. ㄷ GAL-GNR의 최종 합성 제품
<그림>
GNR 및 GAL-GNR의 특성화. 아 GNR의 TEM 현미경 사진(스케일 =0.5 μm/50 nm). ㄴ GAL-GNR의 TEM 현미경 사진(스케일 =0.5 μm /50 nm). ㄷ 다른 수정된 GNR의 입자 크기 분석. d 다른 수정된 GNR(GAL-GNR)의 제타 전위 분석. 이 다른 수정된 GNR과 물의 정규화된 UV-Vis 흡수 스펙트럼. 에 GAL-GNR의 NMR 흡광도 스펙트럼
GAL-GNR의 siRNA 캡슐화 능력 및 안정성
GAL-GNR 나노 골격은 정전기 상호작용을 통해 음전하를 띤 siRNA와 결합될 수 있는 양전하 PEI에 의해 수정되었습니다. 우리는 GAL-GNR의 siRNA 결합 능력을 평가하기 위해 gel shift assay를 사용했습니다. 자유 siRNA는 결합된 siRNA가 느려지거나 완전히 멈추는 동안 겔의 통로를 따라 이동할 수 있습니다. 또한, 결합된 siRNA는 더 이상 bromide에 효과적으로 결합하지 않으므로 그에 따라 형광 강도가 감소합니다. 겔 전기영동 결과 GAL-GNR을 siBRAF로 포화시키기 위한 최적의 비율은 6:1(w/w)입니다(그림 2a).
<사진>
겔 이동 분석. 아 GAL-GNR의 siRNA 로딩 용량. siRNA 1마이크로그램을 GAL-GNR의 다른 질량비로 동일한 부피로 혼합했습니다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 겔 이동 분석을 사용하여 GAL-GNR의 siRNA 로딩 용량을 평가했습니다. ㄴ 마우스 혈청에서 siRNA의 안정성. 1 마이크로그램의 BARF siRNA에 1:6의 질량비로 GAL-GNR을 접종한 후 신선한 쥐 혈청에 첨가했습니다. 37°C에서 0, 3, 6, 12, 24 및 48시간 반응 후 GAL-GNR-siBARF에서 siRNA를 2% SDS로 추출하고 Ethidium Bromide로 시각화했습니다.
Naked siRNA는 특히 생체 내에서 매우 분해됩니다. 전달 시스템의 중요한 기능은 siRNA가 분해되지 않도록 보호하는 것입니다. 따라서 우리는 결과적으로 신선한 혈청에서 siRNA에 대한 나노운반체 GAL-GNR의 보호 효과를 테스트했습니다. 네이키드 siRNA와 비교하여 결합된 siRNA는 더 오랜 기간 동안 혈청에 저장되었습니다. 그림 2b에서 볼 수 있듯이, 결합된 siRNA는 48시간 후에도 여전히 풍부한 반면, 네이키드 siRNA는 최대 12시간 동안 혈청에 존재할 수 있습니다. 결과는 GAL-GNR이 siRNA가 혈청에서 분해되는 것을 효과적으로 방지하여 생체 내 표적 전달을 보장할 수 있음을 입증했습니다.
나노물질의 세포독성
낮은 생물학적 독성은 나노 물질의 또 다른 중요한 특성으로 암 치료에 사용할 수 있습니다. 이 새로운 GAL-GNR 나노구조의 생체적합성을 평가하기 위해 세포독성을 테스트했습니다. 도 3에 나타난 바와 같이, GNR 비변형군에서 Hepa1-6의 죽은 세포는 초기에 30 μg/mL의 낮은 농도에서 관찰되었다. 75 μg/mL GNR과 함께 24시간 동안 배양한 후 세포 사멸률은 최대 56.09%였으며 48시간 동안 배양한 후 사망률은 75.5%로 증가했습니다. 반대로, GAL 변형은 세포독성을 유의하게 감소시켰다. 48시간 동안 GAL-GNR을 배양한 후, 80% 이상의 세포가 고농도(105μg/mL)에서도 여전히 살아 있었습니다. 이러한 데이터는 나노운반체 GAL-GNR이 GNR에 비해 생체적합성이 높아 적용의 안전성을 보장함을 시사한다.
<그림>
GAL-GNR의 독성. Hepa1-6 세포를 표시된 농도에서 24시간 또는 48시간 동안 GNR(CTAB-GNR) 또는 GAL-GNR로 처리했습니다. 세포 생존력은 MTT 분석(n =5)
간암 세포 - siRNA의 표적 전달 및 시험관 내 BRAF의 유전자 침묵
siRNA를 암세포에 전달하는 능력은 나노물질의 가장 중요한 기능 중 하나입니다. siRNA 전달에서 GAL-GNR의 가능성을 조사하기 위해 우리는 Hepa1-6 세포에서 GAL-GNR에 의해 로딩된 siBRAF를 사용하여 유전자 침묵의 효능을 검출했습니다. 빈 그룹과 비교하여 GAL-GNR-siGL2(음성 대조군) 형질감염된 세포에서 BRAF의 발현은 변화가 없는 반면 GAL-GNR-siBRAF로 형질감염된 세포는 유의하게 감소하였다(도 4a). 더욱이, 침묵 효과는 용량 의존적이었고, 이는 GAL-GNR 농도의 증가와 상관관계가 있었다. qPCR 결과는 GAL-GNR-siBRAF의 이상적인 형질감염 농도가 30 μg/mL이고 침묵 효율이 90.29%에 도달할 수 있음을 입증했으며 이는 리포펙타민 2000 그룹(양성 대조군)과 유사했습니다. Western blot 결과는 qPCR과 일치하였고, 48시간 transfection 후에 BRAF의 단백질 발현이 하향조절되었다(Fig. 4b).
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시험관 내에서 siRNA의 간암 세포 표적 전달 및 BRAF의 유전자 침묵. 아 GAL-GNR-siBRAF 형질감염 후 BRAF 발현의 mRNA. Hepa1-6 세포는 24시간 동안 동일한 양의 BRAF siRNA(1 μg)를 운반하는 다양한 농도의 GA-GNR로 형질감염되었습니다. BRAF mRNA의 발현은 qPCR에 의해 결정되었다. 오차 막대는 세 가지 실험의 표준 편차를 나타냅니다(***p <0.001). ㄴ GAL-GNR-siBRAF 형질감염 후 Hepa1-6에서 BRAF의 단백질 발현. Hepa1-6 세포를 GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 또는 PBS로 48시간 동안 형질감염시키고, BRAF 및 β-액틴의 수준을 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. ㄷ 그리고 d GAL-GNR-siBRAF의 간암 표적 전달 능력. cy3로 표지된 siBRAF 1마이크로그램을 lip2000, PEI-GNR(30 μg/mL), GAL-GNR(30 μg/mL)과 함께 실온에서 20분 동안 배양한 다음 Hepa1-6 세포의 배지에 첨가했습니다. 경쟁 억제 분석을 위해 Hepa1-6 세포를 락토비온산으로 밤새 사전 처리했습니다. 세포내 형광 강도는 형광현미경(scale bar =200 μm)으로 관찰하였고, BRAF의 mRNA 발현은 q-PCR로 정량하였다. 오차 막대는 세 가지 실험의 표준 편차를 나타냅니다(*p <0.05)
Lactobionic acid는 간세포암 세포막 표면에 발현되는 ASGPR(asialoglycoprotein receptor)과 경쟁적으로 결합할 수 있는 구조로 GAL과 유사하다[35]. GAL-GNR의 특정 표적화 효율을 확인하기 위해, Hepa1-6 세포를 락토비온산과 함께 사전 인큐베이션한 다음 GAL-GNR-siBRAF로 형질감염시켰다. 처리되지 않은 세포를 블랭크 대조군으로 사용하고 고전적인 형질감염 시약 리포펙타민 2000을 양성 대조군으로 사용했습니다. 도 4c에 도시된 바와 같이, GAL-GNR-형질감염된 세포의 적색 형광 강도는 양성 대조군과 유사한 반면, PEI-GNR-형질감염된 세포의 형광 강도는 유의하게 감소하였다. 한편, GAL-GNR-siBRAF 단독으로 형질감염된 세포는 lactobionic acid로 전처리한 Hepa1-6 세포보다 Cy3의 더 강한 적색 형광을 관찰하였고(도 4c), qPCR 결과는 적색 형광 결과와 일치하였다(도 4c). 그림 4d). 이러한 결과는 GAL이 Hepa1-6 세포에 의한 siRNA의 세포내이입을 효과적으로 촉진하고 HCC의 표적 부분으로 적용될 수 있음을 추가로 보여줍니다.
GAL-GNR-siBRAF가 Hepa1-6 세포의 증식, 이동 및 침범에 미치는 영향
BRAF는 세포 증식, 이동 및 침입을 조절하는 MAPK 경로에서 중요한 역할을 합니다[36]. GAL-GNR-siBRAF가 간세포 암종 세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 먼저 MTT 분석으로 세포 증식을 분석했습니다. 도 5a에 도시된 바와 같이, GAL-GNR-siBRAF-형질감염된 hepa1-6 세포의 증식은 GAL-GNR-siGL2(음성 대조군) 또는 PBS 처리된 세포에 비해 유의하게 감소하였다. 다음으로, 우리는 스크래치 및 트랜스웰 분석에 의한 세포 이동에 대한 GAL-GNR-siBRAF의 효과를 조사했습니다. Compared with negative control cells, the migration ability of Hepa1-6 cells that transfected with GAL-GNR-siBRAF was evidently reduced (Fig. 5b–d).
The impact of silencing BRAF gene on Hepa1-6 cells by GAL-GNR-siBRAF. 아 Proliferation of Hepa1-6 Cells. Hepa1-6 cells were transfected with GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, or PBS, and the cell proliferation was measured by MTT assay (n =5). The error bar represents the standard deviation of three experiments (*p <0.05). ㄴ Scratch test of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above and then scraped with a 10 μL tip. The cell scratch images were taken at different time points (scale bar =200 μm). ㄷ 및 e Migration and invasion of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above. Cell migration and invasion ability was determined by transwell assay, and imagines were taken at different time points (scale bar =200 μm). d 및 f Columnar statistical analysis of cell migration and invasive capacity (***p <0.001)
To further investigate the potential of GAL-GNR-siBRAF on the invasion, transwell assays were performed. The results showed that hepa1-6 cells transfected with GAL-GNR-siBRAF haven significantly decreased the invasion of Hepal-6, as compared with GAL-GNR-siGL2 or PBS (Fig. 5e and f). The above results implied that knockdown of BRAF gene using GAL-GNR-siBRAF complexes can effectively reduce migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.
Combination Treatment with Photothermal Effect and Gene Silencing of GAL-GNR-siBRAF
Our previous studies have demonstrated that gold nanomaterials can generate thermal energy under near infrared radiation [37]; this phenomenon is called photothermal effect due to LSPR properties of the GNR. Our results showed that, with the increase of GAL-GNR concentration, the heat production capacity of GAL-GNR was enhanced. When the concentration of GAL-GNR is 100 μg/mL, the temperature quickly rises from 24 to over 60 °C. In addition, there was no significant difference in heat production capacity between GNR and GAL-GNR (Fig. 6a).
Photothermal effect induced by GAL-GNR and combination treatment of photothermal effect and gene silencing on liver cancer cells. 아 803 nm near-infrared laser source (2 W/cm
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) was used to irradiate the solution of GNR, GAL-GNR, or distilled water (blank control) for 15 min. The temperature was detected by infrared thermometer at different time point. ㄴ Hepa1-6 cells were treated with PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, or GAL-GNR-siBRAF + Laser, respectively. Green fluorescence of calcein AM (live cells) and red fluorescence of PI (dead cells) were observed under fluorescence microscope
The novel nano-system GAL-GNR-siBRAF possesses three individual characteristics:specific targeting of liver cancer, siRNA-based gene silencing of BRAF, and GNR-offered photothermal effects. Thus, we further study the synergistic therapeutic effect of GAL-GNR-siBRAF in anti-tumor treatment. Hepa1-6 cells without GAL-GNR kept higher viability even under near infrared radiation, suggesting laser itself had no significant effect on tumor cells. Once the laser irradiation was carried out on the basis of GAL-GNR-siGL2 treatment, the photothermal effect showed powerful killing ability on Hepa1-6 cells. Although BRAF gene silencing alone induced cell death, the effect was not conclusive. The treatment of cells with the nano-material GAL-GNR-siGL2 plus laser irradiation resulted in much stronger cell-killing ability than BRAF gene silencing individual (Fig. 6b). These data indicates that the BRAF gene silencing and photothermal effect can synergistically increase the potential of killing tumor cells.
Discussion
Difficulties in tumor-targeted delivery are major obstacles in the clinical treatment of tumors. This study demonstrated for the first time that we have developed a novel multifunctional nanocarrier GAL-GNR-siBRAF, and it was provided with many advantages. The modified GAL-GNR not only possessed good biocompatibility but also maintained the LSPR phenomena of GNR skeleton and still has excellent photothermal conversion ability. GNR modified with GAL can home hepatocellular carcinoma cells through ASGPR, which has great potential in targeted molecular therapy of hepatocellular carcinoma. Further studies showed that BRAF gene silencing inhibited the proliferation, migration, and invasion of hepatoma cells. It is worth noting that GAL-GNR-siBRAF shows a stronger cell killing ability in the combination of photothermal effect and gene silencing of BRAF.
RNA interference (RNAi) has attracted much attention due to its crucial role in gene expression and regulation. Using siRNA to knock down sequence-specific genes in cancer cells for gene therapy is an effective and specific targeted gene therapy, and which has become a new therapeutic tool for many diseases including cancer [29, 31]. However, low stability in serum and poor cell uptake limit siRNA in clinical application [38]. On the other hand, siRNA possess negative charge that prevents it from binding negatively charged cell membranes, and siRNA itself is unlikely to be delivered directly into cells [32, 39]. In addition, there are problems associated with low transfection efficiency and poor cell internalization in siRNA therapy [40]. These barriers impede the delivery of siRNA to target cells. To enhance siRNA stability and to strengthen gene silencing efficacy, we synthesized a novel nanocarrier, GAL-GNR-siBRAF, which includes three components (Scheme 1). This nanocarrier has low molecular size (about 30-nm longitude and 10-nm diameter) and good dispersibility (Fig. 1). Additionally, GAL-GNR-siBRAF could effectively load large amount of siRNA at low concentration (Fig. 2a) and protect siRNA degradation from RNase in serum; the siRNA was evidenced by stability for at least two days at 37 °C in the presence of fresh murine serum (Fig. 2b).
Good biocompatibility is essential for nanomaterials used in the field of biotherapy. CTAB is an essential active reagent in the synthesis of gold nanorods although it has apparent cytotoxicity that limits its biological application [41]. In order to reduce the cytotoxicity of the material, we manipulated the GNR by external modification of positive charge PEI and targeting adaptor GAL (d-galactose). Our results showed that, compared with unfunctionalized GNR, GAL-modified GNR has a better biocompatibility. The cell viabilities maintained over 80% even at very high concentrations (105 μg/mL) of GAL-GNR for 48 h (Fig. 3). In addition, the small molecular size and cylindrical shape of the nanorod facilitate its penetration through the cell membrane into the cell [37, 38, 42]. This phenomenon is particularly evident in targeted therapy of cancer cells. Nano-construct modified with the galactose-targeting moieties resulted in high accumulation of GAL-GNR-siBRAF in tumor cells, inducing effective downregulation of BRAF gene expression (Fig. 4). Moreover, according to the competitive inhibition experiments, we found that GAL-GNR entered cells mainly through ASGPR surface receptors of Hepa1-6 cells (Fig. 4c).
It was reported that HCC with high expression of BRAF and RAF1 tends to have rapid proliferation and growth [41, 43, 44]. B-Raf and Raf1 mainly act on the downstream of ERK/MAPK pathway, regulating nuclear factors through cascade amplification. Activation of this pathway accelerates the proliferation and differentiation of HCC cells abnormally [41, 44, 45]. RAF gene can also promote the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), which can change the adhesion of tumor cells, degrade extracellular matrix (ECM) and basement membrane, and promote the invasion and metastasis of tumors [44, 45]. BRAF kinase regulates the RAS-RAF-MEK-ERK pathway, which promotes tumor cell proliferation, invasion and metastasis, and allows cell death through apoptosis [5, 46, 47]. In previous work, we found that BRAF gene was highly expressed in Hepa1-6 cells (data were not shown). It is speculated that the knock down of BRAF expression in Hepa1-6 will block the RAS-RAF-MEK-ERK pathway and lead biological changes of Hepa1-6. To verify our hypothesis, we transfected hepatocellular carcinoma cells with GAL-GNR-siBRAF and found that it can restrain the cell proliferation, migration, and invasion significantly (Fig. 5), providing a new strategy for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.
Another important advantage of GNR is that it possesses local surface plasmon resonance (LSPR), which can convert absorbed light energy into heat energy under near infrared light irradiation, thereby killing and destroying cells [42]. Then, we explored the light-to-heat conversion ability of GAL-GNR, and the results showed that the modified GAL-GNR can induce heat energy effectively under the irradiation of near infrared light (Fig. 6a). Next, we further investigated the synergistic effects of GAL-GNR-siBRAF. Whereas BRAF gene silencing showed limited cytotoxicity, the treatment of GAL-GNR-siGL2 + laser had a much stronger killing ability on tumor cells. At the same time, the combination of photothermal hyperthermia and BRAF gene silencing could cause more than 85% cell death (Fig. 6b) which indicates that the synergy of GAL-GNR-siBRAF and photothermal effects could be an ideal strategy to inhibit liver cancer.
Conclusion
This study showed that GAL-GNR-siBRAF overcome the obstacle of siRNA degradation, effectively increased the stability of siRNA in serum in vitro. In addition, GAL-GNR-siBRAF can target deliver siRNA to hepatocellular carcinoma cells and knockdown the expression of BRAF and inhibit the cell proliferation, invasion, and migration significantly. More importantly, GAL-GNR-siBRAF, as a new multifunctional nanocarrier, can greatly enhance the ability of killing tumor cells when combined with near-infrared light. In conclusion, GAL-GNR-siBRAF has great potential in treatment of hepatocellular carcinoma and provides new ideas for clinical application of liver cancer.
데이터 및 자료의 가용성
All data generated and materials used in this study are included in the manuscript and corresponding additional files.
