간암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. RAF 키나아제 억제제가 간세포암(HCC) 치료에 효과적이므로, BRAF/MEK/ERK 경로 억제는 새로운 HCC 치료 전략이 되었습니다. 그러나 종양 표적 특이적 전달 시스템은 여전히 임상 적용의 큰 걸림돌입니다. 갈락토스(GAL)는 간암 세포에서 고발현되는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)를 표적할 수 있습니다. 본 연구에서는 간암 표적 모티브인 GAL, 근적외선 광하에서 광열 능력을 제공하는 금 나노로드(GNR), BRAF를 특이적으로 침묵시키는 siRNA(siBRAF)로 구성된 새로운 다기능 나노소재 GAL-GNR-siBRAF를 설계했습니다. 나노캐리어 GAL-GNR-siBRAF는 높은 siRNA 로딩 용량과 혈청 내 siRNA 분해 억제 효과를 보였습니다. 맨 금 나노로드에 비해 GAL-GNR-siBRAF는 생체 독성이 낮고 유전자 침묵 효율이 높았습니다. GAL-GNR-siBRAF 처리 시 BRAF 발현이 유의하게 감소하고 간암 세포의 증식, 이동, 침윤이 손상되었습니다. 또한, GAL-GNR-siBRAF의 광열 효과와 BRAF 녹다운 조합이 종양 세포 사멸을 효과적으로 유도했습니다. 따라서 본 연구는 간암 치료를 위한 새로운 표적 다기능 나노소재 GAL-GNR-siBRAF를 개발하여 새로운 임상 치료법 개발에 아이디어를 제공했습니다.
간세포암(HCC)은 주요 글로벌 건강 문제입니다[1]. 전 세계에서 6번째로 흔한 암이며, 암 관련 사망 원인 3위입니다[2, 3]. 대부분의 HCC 사례는 동아시아와 사하라 이남 아프리카에서 발생하지만, 프랑스, 영국, 일본, 미국 등 일부 선진국에서도 발생률이 증가하고 있습니다[4]. 조기 HCC의 표준 치료는 종양의 수술적 절제입니다. 수술 후 5년 생존율은 89-93% 범위입니다[5]. 불행히도 HCC 환자의 약 20-30%만 조기에 진단되며, 대부분(70% 이상)은 진행된 단계에서 발견되어 수술적 절제가 불가능합니다. 다른 치료 옵션으로는 간 이식, 경동맥 화학 색전술(TACE), 전신 화학요법이 있습니다[6]. 그러나 간 이식은 공급이 제한적이고, 불완전한 TACE 색전술은 치료 실패로 이어질 수 있으며, 전신 화학요법의 심각한 부작용과 열악한 전반적 예후로 인해 새로운 HCC 치료법이 임상적으로 절실히 요구됩니다[7].
RAS/RAF 신호 전달 경로는 간암 발생에 필수적 역할을 하며, BRAF는 이 경로에서 필수적인 암 관련 유전자 중 하나입니다. 이 유전자들의 변이는 두 가지 계단식 장애를 초래합니다. RAS/RAF 신호 전달 경로의 비정상적 활성화는 암 환자의 불량한 예후와 관련됩니다[8]. BRAF는 RAF 가족에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며, RAS/RAF 경로 표적화는 HCC 치료를 위한 새로운 치료 전략입니다[8-10]. RAF 키나아제 억제제 소라페닙이 HCC 치료에 유용함이 입증되어 BRAF 돌연변이가 HCC 치료의 선호 표적이 되었습니다[8]. 더 구체적으로, 소라페닙의 임상 개발이 아시아, 유럽, 미국에서 HCC 치료에 적용되면서 BRAF 돌연변이는 진행성 HCC 치료의 바람직한 표적이 되었습니다[11]. 위약 대비 소라페닙은 전체 생존율을 높여 진행성 HCC 환자의 중간 전체 생존을 연장했습니다[12-14]. 그러나 소라페닙은 종양 표적 능력이 낮아 고혈압, 탈모, 메스꺼움 등 부작용을 유발할 수 있습니다[15]. 간암을 높은 특이성으로 표적하고 RAF를 차단하는 약물은 추가 탐구가 필요합니다.
아시알로당단백질 수용체(ASGPR)는 간 갈락토스 수용체로도 알려져 있으며, 간세포의 정현파 표면에 발현되는 C-타입 렉틴입니다[16]. ASGPR은 말단 갈락토스 잔기를 가진 물질의 결합, 내재화, 제거에 중요한 역할을 하므로 간 나노구조의 필수 표적으로 간주됩니다[17]. 여러 단당류(갈락토스, 만노스, 락토스, N-아세틸갈락토사민, 시알산)가 다양한 정도로 ASGPR과 상호작용하며, 갈락토스가 ASGPR에 대한 친화력이 가장 높습니다[18]. ASGPR이 간 실질 세포 표면에 강하게 노출되어 있으므로[19], 이 수용체는 갈락토스 및 갈락토실화 전구약물이나 간 표적 전달 시스템에 강한 친화력을 가집니다. 갈락토스 나노입자[20], 갈락토스 미셀[21], 갈락토스 리포좀[22]이 간 표적 약물 시스템으로 확인되어 간세포암 세포를 특이적으로 표적합니다.
금 나노로드(GNR)는 막대 모양의 금 나노입자로 나노캐리어로서 중요한 이점을 가집니다[23]. GNR은 우수한 생체적합성을 가지며 siRNA의 안정적 전달에 사용될 수 있습니다[24]; 큰 비표면적을 가져 특정 종양 표적 어댑터의 유연한 수정이 가능합니다[25]; 근적외선 조사 하에서 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)이 높은 광열 변환 효율을 보여 우수한 광열 항종양 소재가 됩니다[26]. GNR의 종횡비를 조절하여 최대 광열 효율을 달성할 수 있습니다. 금 나노입자의 체내외 독성은 크기, 표면 전하, 표면 코팅에 의존합니다[27]. 그러나 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)는 금 나노로드 합성의 필수 활성제로, 명백한 세포독성이 있어 생물학적 응용을 제한합니다[28].
RNA 간섭(RNAi)은 작은 간섭 RNA(siRNA)로 표적 유전자를 효과적으로 녹아웃하거나 침묵시키기 때문에 암 치료의 유망한 접근법이 되었습니다[29]. 최근 siRNA 분자가 인체 시험 단계에 진입했으며 다중 돌연변이 유전자 암 및 종양 치료의 유망한 방법으로 간주됩니다[30]. 그러나 siRNA 적용은 혈청 불안정성(세포외 환경의 뉴클레아아제에 의한 분해)과 오프타겟 효과 등 엄청난 과제에 직면해 있습니다[31]. 또한 siRNA는 음전하를 띠어 음전하 세포막과의 결합을 방해합니다[32]. 이러한 특성으로 인해 siRNA 자체를 직접 세포에 전달하기는 어렵습니다. siRNA의 안정성은 siRNA 화학적 변형이나 보호 캐리어 소재에 siRNA 로더 삽입으로 개선할 수 있습니다[33].
본 연구에서는 새로이 다기능 나노캐리어 GAL-GNR-siBRAF를 구축했습니다. 이 시스템은 광열 발생 능력을 가진 금 나노로드를 내부 코어로 하고, 외부에는 간 종양 특이적 표적인 GAL(d-갈락토스)로 수정했습니다. 이 시스템은 금 나노로드 표면의 CTAB 생물학적 독성을 감소시키고, 높은 siRNA 로딩 용량을 보이며, 간암에서 BRAF 유전자를 효과적으로 침묵시킬 수 있습니다. GAL-GNR-siBRAF 적용으로 간암 세포의 증식, 침윤, 이동이 유의하게 감소했습니다. 또한, GAL-GNR-siBRAF는 BRAF 유전자 침묵과 광열 효과를 동시에 유도하여 종양 세포 사멸 능력에서 시너지 효능을 달성했으며, 간암 임상 치료 개발에 새로운 사고방식을 제공했습니다.
마우스 간세포암 세포주 Hepa1-6은 중국과학원 줄기세포은행에서 구입했습니다. 세포는 10% FBS를 함유한 DMEM 배지(Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양했습니다.
BRAF 유전자 표적 siRNA 서열은 5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3'이며 Dharmacon, Inc.(Lafayette, CO, USA)에서 합성했습니다. 상업적으로 이용 가능한 표적 루시페라제 유전자 siGL2를 음성 대조군 siRNA로 사용했습니다.
수용성 금 나노로드는 종자 매개 성장법으로 합성했습니다[34]. 종자 용액 제조: 1 mL 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)(0.2 M)(신팜)와 1 mL HAuCl₄(0.5 mM)(신팜)을 부드럽게 혼합했습니다. 28°C에서 교반하며 완전히 혼합한 후 차가운 NaBH₄(0.01 M)(신팜) 0.12 mL를 첨가하여 종자 용액이 갈색으로 변할 때까지 반응시켰습니다. 성장 용액 합성: 50 mL CTAB(0.2 M), 50 mL HAuCl₄(1 mM), 2.5 mL AgNO₃(4 mM)(신팜)을 28°C에서 가볍게 혼합했습니다. 완전히 혼합한 후 아스코르브산(0.079 M) 670 μL를 첨가하여 용액 색이 진한 노란색에서 무색으로 변하게 했습니다. 종자 용액 120 μL를 28°C에서 부드러운 교반 하에 첨가하여 색이 보라색에서 보라색-검정색으로 점차 변하고 투명해지게 했습니다. 24시간 동안 일정 온도에서 교반 후 12,000 rpm으로 10분 원심분리하여 여분의 CTAB를 제거하고 진공 동결건조하여 향후 사용을 위해 GNR 분말을 얻었습니다.
머캅토운데카노산(MUA; 654 mg)을 30 mL 클로로포름(CHCl₃)에 녹인 후 100 mmol 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염(EDC)과 100 mmol N-하이드록시석시나미드(NHS)로 15분간 실온에서 반응시켰습니다. 이후 100 mmol 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가했습니다. 실온에서 24시간 반응 후 동량의 탈염수로 수용성 PEI-MUA를 추출했습니다. 동일한 방법으로 수용액에서 d-갈락토스 활성화를 완료했습니다. 이후 활성화된 d-갈락토스(500 mmol)를 과량으로 상기 수용성 PEI-MUA 용액에 첨가하고 실온에서 24시간 충분히 반응시켜 수용성 GAL-PEI-MUA 복합체를 얻었습니다.
동결건조된 CTAB-GNR 분말(10 mg)을 수용성 PEI-MUA 또는 GAL-PEI-MUA 복합체 10 mL에 현탁했습니다. 실온에서 24시간 교반 시 CTAB가 Au-S 결합으로 치환되었습니다. 12,000 rpm으로 15분 원심분리하여 여분의 상등액을 제거하고 침전물을 증류수로 3회 세척했습니다. PEI-GNR 또는 GAL-GNR 분말을 동결건조하여 무게를 측정하고 무리보자임수에 용해한 후 다기능 효소 분석기(Spectra Max M5e, MD, USA)로 플라즈몬 공명 효과를 관찰했습니다.
GNR 또는 GAL-GNR을 증류수에 현탁하고 재현탁액을 구리 그리드에 올렸습니다. 구리 망상의 시료를 공기 중에서 30분간 완전히 건조한 후 투과 전자 현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)으로 이미징했습니다.
GNR, PEI-GNR, 또는 GAL-GNR을 증류수에 현탁했습니다. 나노소재의 표면 플라즈몬 공명 효과를 600-900 nm 파장 범위에서 다기능 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M5e, MD, USA)로 조사했습니다.
GNR, PEI-GNR, 또는 GAL-GNR을 증류수에 현탁한 후 제타사이저 나노 ZS로 나노소재의 제타 전위와 유체역학적 직경을 측정했습니다.
GAL-GNR 동결건조 분말을 중수(99%, Sigma)에 녹여 균질한 현탁액을 만들고 NMR 시료 튜브에 옮겼습니다. GAL-GNR의 조성을 핵자기 공명(NMR)(Bruker, 600MHz, Germany)으로 분석했습니다.
GAL-GNR과 siBRAF를 질량비(0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1)로 혼합했습니다. 실온에서 30분 배양 후 DNA 로딩 버퍼를 혼합물에 첨가했습니다. 모든 시료를 0.01% 골드뷰(Bioshop, USA)를 함유한 2% 아가로스 겔에 주입하고 90 V로 30분 전기영동했습니다. siBRAF 포장 정도는 겔 이미징 시스템으로 시각화했습니다.
GAL-GNR-siBRAF(6:1) 혼합물을 신선한 마우스 혈청에서 37°C로 0, 3, 6, 12, 24, 48시간 각각 배양했습니다. 나킷 siBRAF + 신선한 마우스 혈청 그룹도 동일 조건으로 처리했습니다. GAL-GNR-siBRAF 용액에 동량의 2% 소듐 도데실 황산염(SDS)을 첨가했습니다. 실온에서 30분 배양 후 DNA 로딩 버퍼를 첨가하고 모든 시료를 0.02% 골드뷰(Bioshop, USA)를 함유한 2% 아가로스 겔에 주입하여 90 V로 30분 전기영동했습니다. siBRAF의 밴드 밝기를 겔 이미징 시스템으로 시각화했습니다.
2 × 10⁵ Hepa1-6 세포를 12웰 마이크로플레이트에 하룻밤 배양했습니다. 이후 세포를 락토비온산으로 12시간 전처리하고 GAL-GNR-siBRAF(Cy3 표지)로 30분 트랜스펙션했습니다. 세포 내 형광 강도를 형광 현미경으로 측정했습니다(스케일 바 = 200 μm).
Cy3 표지 siBRAF 1 μg을 PEI-GNR(30 μg/mL), GAL-GNR(30 μg/mL)과 실온에서 20분 배양한 후 Hepa1-6 세포 배지에 첨가했습니다. 30분 배양 후 50% FBS로 3회 세척하고 형광 현미경으로 세포 내 형광 강도를 측정했습니다.
20, 40, 60, 80, 100 μg GAL-GNR과 100 μg GNR 동결건조 분말을 각각 1 mL 증류수에 완전히 용해했습니다. 용액을 24웰 플레이트에 넣고 803 nm 근적외선 레이저 소스(2 W/cm²)로 15분간 지속 조사했습니다. 각 그룹의 온도를 적외선 온도계로 처음 5분간 0.5분마다 기록하고 이후 1분마다 표시했습니다.
세포(3.5 × 10⁴/mL) 200 μL를 96웰 마이크로플레이트에 24시간 배양한 후 서로 다른 농도의 GNR 또는 GAL-GNR(0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL)과 배양했습니다. 24 또는 48시간 배양 후 20 μL MTT를 배양 시스템에 첨가하고 추가 4시간 배양했습니다. 보라색 결정을 150 μL DMSO에 녹인 후 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M5e, MD, USA)에서 490 nm 분광광도 분석을 수행했으며 650 nm를 참고 파장으로 사용했습니다.
Hepa1-6 세포(1.5 × 10⁵)를 12웰 플레이트에 하룻밤 두고 PBS, 레이저, GAL-GNR-siBRAF(30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2(30 μg/mL:1 μg) + 레이저, GAL-GNR-siBRAF(30 μg/mL:1 μg) + 레이저로 4시간 처리한 후 근적외선(808 nm, 2 W/cm²)으로 15분 조사했습니다. GAL-GNR의 세포독성을 calcein-AM(생존 세포)과 PI(사멸 세포) 염색 실험으로 검출했습니다. Calcein-AM의 녹색 형광과 PI의 적색 형광을 형광 현미경으로 촬영했습니다.
Trizol(Trizol reagent, Invitrogen)로 전체 세포 RNA를 추출하여 cDNA 합성 주형으로 사용했습니다. 유전자 특이적 정방향 및 역방향 프라이머(각 0.5 μL × 10 μM)를 사용하여 Stratagene Mx3000P qRT-PCR 시스템(Agilent Technologies, Lexington, MA, USA)에서 Q-PCR을 수행했습니다. SYBR green PCR MasterMix(Life Technologies)를 제조사 프로토콜에 따라 사용했습니다. 하우스키핑 유전자 β-actin을 내부 대조군으로 사용했습니다. 프라이머 서열: β-actin: 5'AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3'(정방향), 5'ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'(역방향); BRAF: 5'-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3'(정방향), 5'-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3'(역방향). 유전자 발현 차이는 2⁻ΔΔCt 법으로 계산하여 표시했습니다.
Hepa1-6 세포의 전체 단백질을 RIPA 버퍼(Cell signaling, Pickering, Ontario, Canada)로 추출하고 비신코닌산(BCA)법으로 정량했습니다. 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 전이했습니다. 하우스키핑 유전자 β-actin을 내부 대조군으로 하여 BRAF 단백질 발현을 검출했습니다. 표적 단백질의 단백질 밴드와 내부 대조군을 ECL 화학발광으로 검출했습니다.
트랜스펙션된 Hepa1-6(1.7 × 10⁵/mL) 세포를 12웰 플레이트에 하룻밤 배양했습니다. 플레이트에 완전히 부착된 세포를 10-μL 피펫 팁으로 긁었습니다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 2% FBS 함유 배지로 교체했습니다. 0, 24, 48시간 후 현미경으로 평균 상처 선을 관찰했습니다. 각 스크래치 시험은 3회 반복 수행했습니다.
8-마이크로미터 트랜스웰 챔버(Corning Life Science)를 사용하여 세포 이동과 침윤을 평가했습니다. Hepa1-6 세포를 무혈청 배지 200 μL에 현탁하여 상부 챔버에 웰당 1.7 × 10⁵ cells/mL 밀도로 넣고, 하부 챔버에 12% FBS 함유 배지 500 μL를 첨가했습니다. 24-48시간 배양 후 4% 파라포름알데히드 용액으로 30분 고정하고 1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 30분 염색했습니다. 마지막으로 역위 현미경으로 세포를 촬영하고 계수했습니다. 세포 침윤 분석의 경우 ECM 겔 코팅이 필요하며 나머지 단계는 동일합니다.
모든 실험은 3회 반복 수행했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하고 양측 Student's t-검정으로 두 그룹 간 차이를 결정했습니다. 다중 그룹 비교에는 일원분산분석(ANOVA)을 사용했습니다. 데이터는 p < 0.05(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)에서 통계적으로 유의한 것으로 간주했습니다.
우리는 siRNA를 간 세포로 전달하면서 금 나노로드의 광열 효과를 동시에 유지할 수 있는 새로운 나노캐리어 GAL-GNR을 설계했습니다. GAL-GNR 합성 과정은 Scheme 1에 나와 있습니다. 이 간 표적 시스템은 세 가지 기능적 구성요소를 포함합니다. 첫째, GAL-GNR의 기본 부분은 GNR 골격으로, TEM 이미지(그림 1a)에서 약 30 nm 길이, 10 nm 직경임을 확인할 수 있으며, 화학적으로 접합된 GNR(GAL-GNR)은 유의미한 치수 변화 없이 여전히 우수한 분산성을 보였습니다(그림 1b). 입자 크기 데이터에서 GNR의 평균 크기는 30.23 nm로 전자현미경 결과와 일치했으며, GAL-GNR(50 nm)과 PEI-GNR(42.35 nm)의 크기는 GAL과 PEI 접합으로 인한 입자 간 수화 증가로 GNR보다 컸습니다(그림 1c). 둘째, GNR 표면의 생물학적 독성 CTAB가 양전하 MUA-PEI로 치환되어 음전하 siRNA를 로딩할 수 있게 되었습니다. 제타 전위 측정에서 GNR의 표면 전하가 PEI 또는 GAL-PEI 수정 시 35.6에서 42.7 mV 또는 41.8 mV로 증가하여 GAL-GNR이 siRNA와 강한 결합 능력을 가짐을 보여주었습니다(그림 1d). 셋째, 우리는 GAL을 안내 분자로 사용하여 GNR 나노캐리어를 접합시켰으며, 이는 간세포암의 특이적 호밍에 사용될 수 있습니다. UV-Vis 흡수 분광법으로 수정된 GNR의 구조를 예비적으로 검출했습니다. 비수정 GNR의 초기 흡수 스펙트럼 파장은 763 nm였으며, MUA-PEI 수정 초기에 7 nm 파장 이동이 관찰되었고, GAL로 GNR 수정 완료 시 추가로 8 nm 이동이 관찰되었습니다(그림 1e). 나노시스템 내 GAL을 확인하기 위해 NMR 이미지로 화학기를 분석했습니다. 결과는 NMR 수소 스펙트럼에서 갈락토스의 H 신호가 GAL-GNR 스펙트럼에서만 발견되었으며, δ: 3.60, 3.65, 3.70, 3.78, 3.90, 4.53이었습니다. NMR 스펙트럼은 GAL의 화학 구조를 확인했으며, GAL이 GNR 표면에 성공적으로 접합됨을 입증했습니다(그림 1f).
GAL-GNR 나노 골격은 양전하 PEI로 수정되어 정전기적 상호작용으로 음전하 siRNA와 결합할 수 있습니다. 우리는 젤 시프트 분석으로 GAL-GNR의 siRNA 결합 능력을 평가했습니다. 자유 siRNA는 겔 통로를 따라 이동하지만 결합된 siRNA는 느려지거나 완전히 멈춥니다. 또한 결합된 siRNA는 더 이상 브로마이드와 효과적으로 결합하지 않아 형광 강도가 감소합니다. 겔 전기영동 결과 GAL-GNR을 siBRAF로 포화시키는 최적 비율은 6:1(w/w)이었습니다(그림 2a).
나킷 siRNA는 특히 체내에서 매우 쉽게 분해됩니다. 전달 시스템의 중요한 기능은 siRNA를 분해로부터 보호하는 것입니다. 따라서 나노캐리어 GAL-GNR의 siRNA 보호 효과를 신선한 혈청에서 테스트했습니다. 나킷 siRNA에 비해 결합된 siRNA가 혈청에서 더 오랜 기간 저장되었습니다. 그림 2b에서 나킷 siRNA는 혈청에서 최대 12시간까지 존재할 수 있었으나 결합된 siRNA는 48시간 후에도 여전히 풍부했습니다. 이 결과는 GAL-GNR이 혈청에서 siRNA 분해를 효과적으로 방지하여 체내 표적 전달을 보장함을 보여줍니다.
낮은 생물학적 독성은 나노소재가 암 치료에 사용될 수 있게 하는 또 다른 중요한 특성입니다. 이 새로운 GAL-GNR 나노구조의 생체적합성을 평가하기 위해 세포독성을 시험했습니다. 그림 3에서 미수정 GNR 처리 그룹의 Hepa1-6 사멸 세포가 30 μg/mL 저농도에서 처음 관찰되었습니다. 75 μg/mL GNR로 24시간 배양 후 세포 사멸률이 56.09%까지 상승했고, 48시간 배양 후 75.5%로 증가했습니다. 반대로 GAL 수정으로 세포독성이 유의하게 감소했습니다. GAL-GNR 48시간 배양 후 고농도(105 μg/mL)에서도 80% 이상 세포가 생존했습니다. 이 데이터는 나노캐리어 GAL-GNR이 GNR에 비해 높은 생체적합성을 가지며 적용 안전성을 보장함을 시사합니다.
siRNA를 암 세포로 전달하는 능력은 나노소재의 가장 중요한 기능 중 하나입니다. GAL-GNR의 siRNA 전달 잠재력을 조사하기 위해 Hepa1-6 세포에서 GAL-GNR에 로딩된 siBRAF의 유전자 침묵 효능을 검출했습니다. 빈 그룹에 비해 GAL-GNR-siGL2(음성 대조군) 트랜스펙션 세포에서 BRAF 발현에 변화가 없었으나, GAL-GNR-siBRAF 트랜스펙션 세포에서는 유의하게 감소했습니다(그림 4a). 또한 침묵 효과는 용량 의존적이었으며 GAL-GNR 농도 증가와 상관관계를 보였습니다. qPCR 결과 이상적인 GAL-GNR-siBRAF 트랜스펙션 농도는 30 μg/mL였으며 침묵 효율은 90.29%에 달해 리포펙타민 2000(양성 대조군) 그룹과 유사했습니다. 웨스턴 블롯 결과도 qPCR과 일치했으며, 48시간 트랜스펙션 후 BRAF 단백질 발현이 감소했습니다(그림 4b).
락토비온산은 GAL과 구조가 유사하여 간세포암 세포막에 발현된 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)와 경쟁적으로 결합할 수 있습니다[35]. GAL-GNR의 특이적 표적 효율을 확인하기 위해 Hepa1-6 세포를 락토비온산으로 전처리한 후 GAL-GNR-siBRAF로 트랜스펙션했습니다. 미처리 세포를 빈 대조군으로, 고전적 트랜스펙션 시약 리포펙타민 2000을 양성 대조군으로 사용했습니다. 그림 4c에서 GAL-GNR 트랜스펙션 세포의 적색 형광 강도는 양성 대조군 그룹과 유사했으나 PEI-GNR 트랜스펙션 세포의 형광 강도는 유의하게 감소했습니다. 반면, GAL-GNR-siBRAF 단독 트랜스펙션 세포에서는 락토비온산으로 전처리된 Hepa1-6 세포보다 더 강한 Cy3 적색 형광이 관찰되었습니다(그림 4c), qPCR 결과도 적색 형광 결과와 일치했습니다(그림 4d). 이 결과들은 GAL이 Hepa1-6 세포의 siRNA 내포작용을 효과적으로 촉진하며 HCC 표적 모티브로 적용될 수 있음을 추가로 입증했습니다.
BRAF는 세포 증식, 이동, 침윤을 조절하는 MAPK 경로에서 중요한 역할을 합니다[36]. GAL-GNR-siBRAF가 간세포암 세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 MTT 분석으로 세포 증식을 먼저 분석했습니다. 그림 5a에서 GAL-GNR-siBRAF 트랜스펙션 Hepa1-6 세포의 증식이 GAL-GNR-siGL2(음성 대조군) 또는 PBS 처리 세포에 비해 유의하게 감소했습니다. 다음으로 스크래치 및 트랜스웰 분석으로 GAL-GNR-siBRAF의 세포 이동 영향을 조사했습니다. 음성 대조군 세포에 비해 GAL-GNR-siBRAF 트랜스펙션 Hepa1-6 세포의 이동 능력이 현저히 감소했습니다(그림 5b-d).
침윤 잠재력을 더 조사하기 위해 트랜스웰 분석을 수행했습니다. 결과는 GAL-GNR-siBRAF 트랜스펙션 Hepa1-6 세포가 GAL-GNR-siGL2 또는 PBS에 비해 침윤이 유의하게 감소함을 보였습니다(그림 5e, f). 위 결과는 GAL-GNR-siBRAF 복합체를 이용한 BRAF 유전자 녹다운이 간세포암 세포의 이동과 침윤을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 시사합니다.
이전 연구에서 금 나노소재가 근적외선 조사 하에서 열에너지를 생성할 수 있음을 입증했습니다[37]; 이 현상은 GNR의 LSPR 특성으로 인한 광열 효과라고 합니다. 우리 결과에 따르면 GAL-GNR 농도 증가에 따라 GAL-GNR의 발열 능력이 향상되었습니다. GAL-GNR 농도가 100 μg/mL일 때 온도가 24°C에서 60°C 이상으로 급격히 상승했습니다. 또한 GNR과 GAL-GNR 간 발열 능력에 유의미한 차이가 없었습니다(그림 6a).
새로운 나노시스템 GAL-GNR-siBRAF는 세 가지 개별 특성을 가집니다: 간암 특이적 표적화, siRNA 기반 BRAF 유전자 침묵, GNR 제공 광열 효과. 따라서 GAL-GNR-siBRAF의 항종양 치료에서 시너지 치료 효과를 추가로 연구했습니다. GAL-GNR 없는 Hepa1-6 세포는 근적외선 조사 하에서도 높은 생존율을 유지하여 레이저 자체가 종양 세포에 유의미한 영향을 미치지 않음을 보여주었습니다. GAL-GNR-siGL2 처리 기반으로 레이저 조사를 수행하면 광열 효과가 Hepa1-6 세포에 강력한 사멸 능력을 보였습니다. BRAF 유전자 침묵 단독으로도 세포 사멸을 유도했으나 효과는 결정적이지 않았습니다. 나노소재 GAL-GNR-siGL2 + 레이저 조사 치료가 BRAF 유전자 침묵 단독보다 훨씬 강한 세포 사멸 능력을 보였습니다(그림 6b). 이 데이터는 BRAF 유전자 침묵과 광열 효과가 시너지적으로 종양 세포 사멸 잠재력을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다.
종양 표적 전달의 어려움은 종양 임상 치료의 주요 장애물입니다. 본 연구에서는 새로운 다기능 나노캐리어 GAL-GNR-siBRAF를 최초로 개발했으며, 이는 여러 장점을 가집니다. 수정된 GAL-GNR은 우수한 생체적합성뿐만 아니라 GNR 골격의 LSPR 현상을 유지하며 여전히 우수한 광열 변환 능력을 가집니다. GAL로 수정된 GNR은 ASGPR을 통해 간세포암 세포로 호밍할 수 있어 간세포암의 표적 분자 치료에 큰 잠재력을 가집니다. 추가 연구에서 BRAF 유전자 침묵이 간암 세포의 증식, 이동, 침윤을 억제함을 보였습니다. 주목할 점은 GAL-GNR-siBRAF가 광열 효과와 BRAF 유전자 침묵 조합에서 더 강한 세포 사멸 능력을 보인다는 것입니다.
RNA 간섭(RNAi)은 유전자 발현과 조절에서 중요한 역할로 많은 주목을 받았습니다. 암 세포에서 siRNA로 서열 특이적 유전자를 녹다운하는 유전자 치료는 효과적이고 특이적인 표적 유전자 치료로, 암을 포함한 많은 질병의 새로운 치료 도구가 되었습니다[29, 31]. 그러나 혈청 내 낮은 안정성과 낮은 세포 섭취가 siRNA의 임상 적용을 제한합니다[38]. 한편 siRNA는 음전하를 띠어 음전하 세포막과의 결합을 방해하며, siRNA 자체를 직접 세포 내로 전달하기는 어렵습니다[32, 39]. 또한 siRNA 치료에서 낮은 트랜스펙션 효율과 낮은 세포 내재화 문제가 있습니다[40]. 이러한 장벽들은 siRNA의 표적 세포 전달을 방해합니다. siRNA 안정성을 높이고 유전자 침묵 효능을 강화하기 위해 세 가지 구성요소를 포함한 새로운 나노캐리어 GAL-GNR-siBRAF를 합성했습니다(Scheme 1). 이 나노캐리어는 낮은 분자 크기(약 30 nm 길이, 10 nm 직경)와 좋은 분산성을 가집니다(그림 1). 또한 GAL-GNR-siBRAF는 저농도에서 대량의 siRNA를 효과적으로 로딩할 수 있습니다(그림 2a)하고 혈청 내 RNase로부터 siRNA 분해를 보호합니다; siRNA는 37°C에서 신선한 마우스 혈청 존재 하에서 최소 이틀간 안정적이었음이 입증되었습니다(그림 2b).
좋은 생체적합성은 생물치료 분야에 사용되는 나노소재에 필수적입니다. CTAB는 금 나노로드 합성의 필수 시약이나 명백한 세포독성으로 생물학적 응용을 제한합니다[41]. 물질의 세포독성을 줄이기 위해 양전하 PEI와 표적 어댑터 GAL(d-갈락토스)로 GNR을 외부 수정했습니다. 우리 결과에 따르면 비기능화 GNR에 비해 GAL 수정 GNR이 더 나은 생체적합성을 보였습니다. GAL-GNR 고농도(105 μg/mL) 48시간 처리 후 세포 생존율이 80% 이상 유지되었습니다(그림 3). 또한 작은 분자 크기와 나노로드의 원통형 모양이 세포막 투과를 촉진하여 세포 내로 진입하게 합니다[37, 38, 42]. 이 현상은 암 세포 표적 치료에서 특히 두드러집니다. 갈락토스 표적 모티브로 수정된 나노구조는 종양 세포에서 GAL-GNR-siBRAF의 높은 축적을 유도하여 BRAF 유전자 발현을 효과적으로 감소시켰습니다(그림 4). 또한 경쟁 억제 실험에 따르면 GAL-GNR은 주로 Hepa1-6 세포의 ASGPR 표면 수용체를 통해 세포 내로 진입합니다(그림 4c).
BRAF와 RAF1 고발현 HCC는 급속한 증식과 성장을 보이는 것으로 보고되었습니다[41, 43, 44]. B-Raf와 Raf1은 주로 ERK/MAPK 경로 하류에서 작용하여 계단식 증폭을 통해 핵 인자를 조절합니다. 이 경로의 활성화는 HCC 세포의 비정상적 증식과 분화를 가속화합니다[41, 44, 45]. RAF 유전자는 기질 금속단백질분해효소(MMPs) 발현을 촉진하여 종양 세포 부착을 변화시키고 세포외 기질(ECM)과 기저막을 분해하여 종양 침윤과 전이를 촉진합니다[44, 45]. BRAF 키나아제는 RAS-RAF-MEK-ERK 경로를 조절하여 종양 세포 증식, 침윤, 전이를 촉진하고 세포 사멸을 허용합니다[5, 46, 47]. 이전 연구에서 BRAF 유전자가 Hepa1-6 세포에서 고발현됨을 발견했습니다(데이터 미표시). Hepa1-6에서 BRAF 발현 녹다운이 RAS-RAF-MEK-ERK 경로를 차단하여 Hepa1-6의 생물학적 변화를 초래할 것으로 추측했습니다. 가설 검증을 위해 GAL-GNR-siBRAF로 간세포암 세포를 트랜스펙션한 결과 세포 증식, 이동, 침윤을 유의하게 억제함을 확인했습니다(그림 5), 이는 간세포암 임상 치료를 위한 새로운 전략을 제공합니다.
GNR의 또 다른 중요한 장점은 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 가져 근적외선 조사 하에서 흡수된 빛 에너지를 열에너지로 변환하여 세포를 사멸 및 파괴할 수 있다는 것입니다[42]. GAL-GNR의 광-열 변환 능력을 탐구한 결과 수정된 GAL-GNR이 근적외선 조사 하에서 효과적으로 열에너지를 유도함을 보였습니다(그림 6a). 다음으로 GAL-GNR-siBRAF의 시너지 효과를 추가로 조사했습니다. BRAF 유전자 침묵이 제한적 세포독성을 보인 반면, GAL-GNR-siGL2 + 레이저 치료가 종양 세포에 훨씬 강한 사멸 능력을 보였습니다. 동시에 광열 고열과 BRAF 유전자 침묵 조합으로 85% 이상의 세포 사멸을 유도할 수 있었습니다(그림 6b). 이는 GAL-GNR-siBRAF와 광열 효과의 시너지가 간암 억제를 위한 이상적 전략이 될 수 있음을 시사합니다.
본 연구는 GAL-GNR-siBRAF가 siRNA 분해 장애를 극복하고 체외에서 siRNA의 혈청 안정성을 효과적으로 증가시킴을 보였습니다. 또한 GAL-GNR-siBRAF는 간세포암 세포에 siRNA를 표적 전달하여 BRAF 발현을 녹다운하고 세포 증식, 침윤, 이동을 유의하게 억제했습니다. 더 중요하게, GAL-GNR-siBRAF는 새로운 다기능 나노캐리어로 근적외선 광과 결합 시 종양 세포 사멸 능력을 크게 향상시킵니다. 결론적으로 GAL-GNR-siBRAF는 간세포암 치료에 큰 잠재력을 가지며 간암 임상 적용에 새로운 아이디어를 제공합니다.
나노물질
초록 저비용 화학 욕 증착(CBD)을 사용하여 다양한 ZnO 나노구조를 성장시킬 수 있습니다. 이 기술은 비용 효율적이고 유연하지만, 최종 구조는 보통 무작위로 배향되어 있으며 균일성과 표면 밀도 측면에서 제어하기 어렵습니다. 본 연구에서는 콜로이드 리소그래피를 사용하여 (100) 실리콘 기판을 패터닝함으로써 나노로드의 형태와 밀도를 완전히 제어했습니다. 또한 졸-겔법으로 제조된 ZnO 시드 층을 사용하여 실리콘 기판과 ZnO 나노로드 간의 격자 불일치를 보상했습니다. 그 결과 패터닝된 레지스트 마스크의 지정된 개구부에서 제어 가능
초록 전통적인 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 비판받아 왔습니다. 나노입자의 돌파구는 전통적 치료와 진단을 업그레이드하는 새로운 접근법을 제공합니다. 실제로 나노입자는 전통적 암 진단과 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단과 치료를 위한 완전히 새로운 관점과 최첨단 장치를 창출합니다. 그러나 대부분의 나노입자 연구는 생체 내외 실험 단계에 머물러 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극소수만 보고되었습니다. 본 리뷰에서는 먼저 나노입자의 암 진단 및 치료 분야 현재 응용을 요약합니다. 이후 나
