ferroptosis를 유도하여 종양 발달을 억제하는 것은 세포 내 산화 불균형에 민감한 삼중 음성 유방암에 대한 잠재적 치료법을 제공할 수 있습니다. 최근에, 아르테미시닌(ART) 및 그 유도체는 엔도퍼옥사이드 다리의 철 매개 절단에 의한 페로프토시스 유도를 통해 매우 공격적인 암 치료를 위한 잠재적인 항암제로 조사되었습니다. 낮은 수용성과 제한된 세포 내 철 함량으로 인해 항종양 요법에서 추가 적용이 어렵습니다. 여기에서 우리는 ART 캡슐화(TA-Fe/ART@ZIF)로 제올라이트 이미다졸레이트 프레임워크-8(ZIF)에 코팅된 탄닌산(TA) 및 제1철 이온(Fe(II))을 기반으로 하는 ART용 철 공급 나노 캐리어를 개발했습니다. ) 조정 기반 자가 조립을 통해. 약물 방출 실험에 따르면 ART는 pH 7.4에서 거의 방출되지 않은 반면 59% ART는 10시간 후에 pH 5.0에서 방출되어 우수한 pH 유발 방출을 보여줍니다. 한편, 높은 수준의 세포 내 ROS 및 MDA는 GSH 및 GPX4의 감소와 함께 새로 개발된 나노 약물 시스템이 현저하게 강화된 ferroptosis를 나타냈습니다. 단일 요법과 비교하여 시험관 내 및 생체 내 종양 억제 실험은 TA-Fe/ART@ZIF의 종양 억제 효율이 더 높은 것으로 나타났습니다. 이 연구는 페로프토시스 나노 의약품의 효능을 강화하기 위한 새로운 접근 방식과 TBNC 치료의 새로운 방향을 제공합니다.
새로 발견된 세포 사멸의 하위 유형인 페롭토시스는 철 의존성 지질 과산화수소(LPO)의 축적을 초래하여 세포 구조와 완전성의 손상을 초래할 수 있습니다[1,2,3]. 여러 소분자에 의한 ferroptosis의 활성화가 다양한 실험적 암 모델에서 종양 억제를 위한 효과적인 접근 방식임을 암시하는 새로운 증거는 새로운 항암 요법으로서 ferroptosis의 잠재력에 대한 높은 기대를 불러일으켰습니다[4,5,6]. 삼중음성유방암(TNBC)은 유방암 결핍 표적치료제의 가장 공격적인 아형이며 종종 종양 재발, 원격 전이 및 치료 내성과 관련이 있습니다[7]. 이전 연구에서는 xCT 시스틴/글루타메이트 항포터가 수많은 TNBC 세포에서 고도로 발현되어 글루타티온(GSH) 수준과 산화환원 균형을 유지하는 데 중요한 역할을 한다고 지적했습니다[8]. 세포 내 GSH 함량의 감소는 TNBC 세포를 페로프토시스에 민감하게 만들어 종양 세포를 죽일 수 있습니다[8]. 특히 ferroptosis는 일상적인 프로그램된 세포자멸사에 대한 TNBC의 저항을 우회할 수도 있습니다[9]. 따라서 ferroptosis 유도에 기반한 전략이나 약물은 난치성 TNBC의 임상 치료에 대한 치료 가능성을 가질 수 있습니다.
과산화물 그룹을 포함하는 세스퀴테르펜 락톤인 아르테미시닌(ART)은 중국 전통 식물 Artemisia annua에서 분리되었습니다. 여러 암 세포주에서 바람직한 항종양 활성을 입증했습니다[10, 11]. 증가하는 증거는 암세포가 정상 세포보다 훨씬 더 많은 세포 내 철 풀을 포함하는 반면 엔도퍼옥사이드 브리지의 철 매개 절단은 ART가 여러 암세포주에서 세포 사멸을 선택적으로 유발할 수 있다는 것을 보여줍니다[12, 13]. 철 이온에 의존하는 항종양 활성은 ART 조절 ferroptosis에 대한 관심이 증가하고 있습니다[13]. 기계적으로 ART는 자가포식과 무관한 방식으로 페리틴의 리소좀 분해를 유도하여 철 이온의 세포 수준을 증가시키고 세포를 페로프토시스에 민감하게 할 수 있습니다[11].
그러나 ART가 TNBC에서 ferroptosis를 유도하는지 여부는 불분명합니다. 또한, 낮은 수용성 및 세포 내 철 이온의 불충분한 이용 가능성과 같은 일련의 요인이 항종양 요법에서 ART의 추가 적용을 제한합니다[13]. ART 나노복합체는 ART 기반 항종양 약물의 유망한 나노 약물 전달 시스템으로 성공적으로 사용될 것으로 기대된다[14,15,16]. 최근에는 다공성 고분자 물질의 일종인 금속-유기 골조(metal-organic frameworks, MOFs)가 큰 기공 크기, 높은 겉보기 표면적 및 소분자의 선택적 흡수로 인해 주목받고 있다[17,18,19]. 제올라이트형 이미다졸레이트 프레임워크(ZIF-8)는 MOF형 물질의 대표적인 것으로 pH 반응성, 높은 약물 로딩, 우수한 생체적합성 특성을 가진 나노 의약품 개발에 널리 사용된다[20,21,22,23 ]. 또한 MOF에 조정 가능한 표면을 통합하는 기능은 표면 속성을 제어하고 다기능을 부여합니다[24, 25]. MOF 표면의 금속-페놀 배위 코트의 초분자 어셈블리는 자극 반응성 분해, 콜로이드 안정성 및 생체 적합성과 같은 바람직한 특성으로 인해 최근 관심을 끌고 있습니다[26, 27]. MOF의 금속-페놀릭 배위 물질은 소수성 ART를 전달하는 이상적인 수단이 될 수 있습니다.
이에 영감을 받아 TNBC 세포에서 ferroptosis를 조절하기 위한 철 이온-탄닌산 배위-은폐 ZIF-8 나노 시스템 캡슐화 ART(TA-Fe/ART@ZIF)를 개발했으며, 이는 그림 1에 나와 있습니다. ZIF-8은 우수한 생체 적합성과 pH 반응성 방출로 인해 ART를 캡슐화하기 위해 나노 캐리어로 선택되었습니다. ferrous ion-TA 배위 코트는 ferrous ion(Fe(II))의 분산 안정성 및 공급을 위해 ART@ZIF 표면에 고정화되었습니다. 세포에서 준비된 나노 시스템의 내부화에 따라 비히클의 산성 분해는 ART의 방출과 Fe(II)의 축적을 촉진할 것입니다. 세포에서 Fe(II) 수준의 상향 조절은 철 매개 엔도퍼옥사이드 다리의 절단을 통해 ART를 라디칼로 분해하여 페로프토시스의 효과를 현저하게 향상시킵니다. 결론적으로, TA-Fe/ART@ZIF 매개 ferroptosis의 발견은 TNBC에 대한 새로운 치료법 개발에 대한 새로운 관점을 제공할 수 있습니다.
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TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 제조 및 종양 세포에서 세포자멸사/페로프토시스의 상승적 유도에 대한 도식적 표현
아르테미시닌(99%), 2-메틸이미다졸(98%), 질산아연(ZnNO3; 98%), Ta(98%), 황산제1철(FeSO4; 98%), 무수 메탄올은 Aladdin-Reagent Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 제공했습니다.
ART@ZIF 나노입자의 제조를 위해 200mg의 ART를 1mL의 무수 메탄올에 녹이고 2g의 2-methylimidazole(용매는 8mL의 무수 메탄올)을 얻어진 ART 용액에 천천히 첨가하였다. 자기 교반 하에 질산아연 0.2g(용매는 무수 메탄올 1mL)을 천천히 첨가했습니다. 마지막으로 용액의 부피를 15mL로 조정하고 10분 동안 교반하여 밝은 흰색 용액을 얻었다. 10,000rpm에서 원심분리한 후 샘플을 메탄올로 3회 세척했습니다. 상등액은 ART의 함량을 측정하기 위한 것이고 침전물은 추가 사용을 위해 고체 상태를 얻기 위해 동결 건조되었습니다.
TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 제조를 위해 TA 용액(탈이온수 중 40mg/mL, 2mL)을 ART@ZIF 용액(10mg/mL, 4mL)에 천천히 첨가했습니다. 20분 동안 교반한 후, 5 mg/mL의 FeSO4 위의 용액에 천천히 첨가하였다. 30분 동안 반복 교반한 후, 진한 보라색 용액을 얻었다. 마지막으로 10,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 수집했습니다. 침전물을 탈이온수로 3회 세척하고 동결 건조하여 추가 사용을 위해 TA-Fe/ART@ZIF를 얻었다.
TEM(JEM-1230; JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 나노 입자의 각 부분의 형태 및 원소 조성을 결정했습니다. 동적 광산란 및 제타 전위(DLS; Zetasizer Nano 시스템 Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 나노입자의 입자 크기 및 전기적 안정성을 평가했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(VERTEX 70; Bruker, Bremen, Germany)과 열중량 분석을 사용하여 나노 입자의 구성 요소 구성을 분석했습니다. X선 광전자 분광법(XPS) 측정은 PHI 5000 Versa Probe III(Physical Electronics)를 사용하여 수행되었습니다. TA-Fe/ART@ZIF 재료의 원소 조성은 EDX(Carl Zeiss Model:Neon-40)를 이용하여 수행하였다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 상청액에서 ART의 양을 측정했습니다. ART의 약물 로딩 및 캡슐화 속도는 다음과 같이 계산할 수 있습니다.
$${\text{약물}}\,{\text{로딩}}\,(\%) =\frac{{{\text{실제}}\,{\text{금액}}\,{\text {of}}\,{\text{drug}}\,{\text{encapsulated}}\,{\text{in}}\,{\text{NPs}}}}{{{\text{Amount} }\,{\text{of}}\,{\text{NPs}}}} \times 100\%$$$${\text{엔트랩먼트}}\,{\text{효율}}\,\% =\frac{{{\text{실제}}\,{\text{금액}}\,{\text{of}}\,{\text{약물}}\,{\text{캡슐화}}\, {\text{in}}\,{\text{NPs}}}}{{{\text{초기}}\,{\text{of}}\,{\text{금액}}\,{\text {of}}\,{\text{약물}}\,{\text{중고}}}} \times 100\%$$2mg의 나노입자로 감싼 처리된 투석막을 각각 pH 7.4와 5.0의 인산완충식염수(PBS) 50mL에 넣고 37°C에서 계속 흔들어주었다. 실험 시작 후 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간 후에 투석막 외부 용액을 샘플링했습니다. 완충용액 중의 ART 함량은 HPLC를 이용하여 측정하였다.
MDA-MB-231 및 L929 세포주는 American Type Culture Collection(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 입수했습니다. 세포는 37°C 및 5% CO2에서 배양되었습니다. 10% 소태아 혈청(Cyclone, Utah, USA), 100μg/mL의 피루브산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신(Solarbio Beijing, China)이 보충된 RPMI-1640 배지(Solarbio, Beijing, China)의 습도.
세포 생존율은 문헌 절차[28, 29]에 따라 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 사용하여 결정되었습니다.
MDA-MB-231 세포 및 L929 세포를 96웰 플레이트의 표준 세포 배지(웰당 5,000개 세포)에서 배양하고 5% CO2에서 배양했습니다. 24시간 동안 37°C에서 웰의 유체를 버리고 PBS 및 다양한 농도의 ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, 데페록사민(DFO, MedChemExpress, Shanghai, China)이 포함된 웰당 100μL의 무혈청 배지 ), N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone(Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, China) 및 ferrostatin-1(Fer1, MedChemExpress, Shanghai, China)이 96에 추가되었습니다. -웰 플레이트. 48시간 후 10μL의 MTT(5mg/mL)를 추가하고 추가로 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 마지막으로 자동 효소 마커(BioTek Instruments Inc., USA)를 사용하여 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 결과는 세포 생존율의 백분율로 표시되었습니다.
MDA-MB-231 세포를 24웰 플레이트(2 × 10 4 웰당 세포) 및 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 그 후, 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자로 처리했습니다. 배지를 버린 후 세포를 4°C의 암실에서 Calcein-AM(Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)으로 염색하고 형광 도립 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰했습니다.
MDA-MB-231 세포를 2.5 × 10 5 밀도로 6웰 플레이트에 넣었습니다. 동일한 조건에서 웰당 세포. PBS로 처리한 후 ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF를 24시간 동안 적용했습니다. 이어서, 세포를 원심분리하고 6-웰 플레이트로부터 수집하였다. propidium iodide 및 Annexin-V 이중 염색(Annexin V-FITC Kit; Beckman Coulter, Marseille, France) 후 유세포 분석을 사용하여 검출했습니다.
세포의 ROS 함량은 ROS 형광 프로브(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate(DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)를 사용하여 수행되었습니다. MDA-MB-231 세포는 6웰 플레이트(2.5 × 10<섭>5 웰당 세포) 및 5% CO2에서 배양 24시간 동안 37°C에서 웰로부터의 유체는 버리고, 세포는 블랭크 대조군(무혈청 배지), 양성 대조군 및 실험군(다양한 농도의 나노입자)으로 처리하였다. 37°C에서 8시간 동안 인큐베이션한 후 0.1% DCFH-DA를 각 웰에 첨가하고 세포를 30분 동안 인큐베이션했습니다. DCFH-DA에 반응하지 않는 세포를 PBS로 제거하고 형광도전현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
MDA assay kit(TBA method; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China)와 GSH assay kit(Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)를 사용하여 MDA와 GSH의 세포내 수치를 측정하였다. PBS, ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF로 처리한 후, MDA-MB-231 세포를 수집하고 계수하였다. MDA 및 GSH의 세포 내 함량은 키트에 제공된 지침에 따라 결정되었습니다.
상이한 나노입자로 처리된 MDA-MB-231 세포를 RIPA 용해 완충액으로 용해시켰다. 단백질 농도를 결정한 후, 10% SDS-PAGE 젤을 사용하여 서로 다른 샘플의 단백질을 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 샘플 단백질이 로딩된 니트로셀룰로오스 멤브레인은 0.5% BSA 단백질 용액으로 1시간 동안 차단되었고, 니트로셀룰로오스 멤브레인과 1차 항체는 4°C에서 24시간 동안 인큐베이션되었습니다. 니트로셀룰로오스 막의 1차 항체를 TBST로 헹구고 해당 2차 항체와 함께 상온에서 2시간 동안 계속 둡니다. 셀룰로오스 멤브레인의 2차 항체를 씻어낸 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 화학발광 용액을 사용하여 젤 이미징 시스템에서 관찰했습니다.
모든 동물 실험은 웨이팡 의과대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 건강한 암컷 누드 마우스(나이:4주, 체중:13–17 g, Vital River, Beijing, China)에 5 × 10 6 을 투여했습니다. 150µl의 인산완충식염수에 MDA-MB-231 세포. 종양 부피가 70–120mm 3 로 증가한 경우 , 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었습니다. 마우스의 각 그룹은 PBS, ART(20mg/kg), TA-Fe/ZIF(80mg/kg) 및 TA-Fe/ART@ZIF(100mg/kg)로 개별적으로 처리되었습니다. 각 마우스는 3일마다 복강내 주사로 치료하였다. 14일 후 모든 쥐가 죽었습니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 종양 조직 및 중요 장기를 수집했습니다.
모든 실험은 적어도 세 번 반복되었습니다. 모든 데이터는 SPSS 버전 22.0 소프트웨어(IBM Corp., Armonk, USA)를 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 피 values <0.05는 통계적 유의성을 나타냅니다.
먼저, ART@ZIF 나노입자는 문헌 절차에 따라 메탄올, 아연 아세테이트, 2-메틸이미다졸 및 ART로부터 실온에서 합성되었다[30]. 안정한 금속-폴리페놀 초분자 필름은 TA와 철 이온을 소용돌이 처리하여 ART@ZIF 템플릿 주위에 빠르게 형성되었습니다. 보고된 자성 나노입자[31,32,33]와 비교하여 TA-Fe/ART@ZIF는 가혹한 화학적 또는 열수 반응 없이 MOF 표면에 TA-Fe 막을 형성하는 자기 조립 방법을 통해 제조되었습니다. 더 중요한 것은, TA-Fe/ART@ZIF 나노운반체가 낮은 pH에 의해 촉발되어 ART와 Fe(II)를 방출할 수 있다는 것입니다. . 1차 원심분리 후 상등액을 이용하여 HPLC로 측정한 캡슐화 효율은 66.7%였다. TA-Fe/ART@ZIF 나노입자에 의해 상청액을 얻었고, ART의 계산된 약물 부하는 11.4%였다. FTIR 분광법(그림 2a)에 따르면 ART의 특징적인 흡수 피크, 즉 1,738cm -1 에서 카르보닐 결합 724cm −1 에서 퍼옥시 브리지 [34], TA-Fe/ART@ZIF 나노입자에서 관찰되었으며, 이는 ART가 나노입자에 성공적으로 캡슐화되었음을 나타냅니다. 다음으로, 열중량 분석 결과 온도가 약 400°C까지 상승하면 ART가 완전히 소멸되는 것으로 나타났습니다(그림 2b). TA-Fe/ZIF 나노입자와 비교하여 ART가 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 총 중량의 7.1%를 차지하는 것으로 나타났으며, 이는 기본적으로 HPLC 분석 결과와 일치합니다.
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아 ART, ZIF-8 및 TA-Fe/ART@ZIF의 FTIR; ㄴ ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF의 열중량 분석(TGA)
TEM의 결과는 ZIF-8과 ART@ZIF가 유사한 균일한 육각형 배열을 나타내고 입자 크기 분포가 약 100nm에서 결정되었음을 보여주었습니다(그림 3a, b). TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 구형 구성을 나타내었고 입자 크기 분포는 150nm였습니다. 완전한 ART@ZIF와 비교하여 Fe(II) 및 TA로 코팅된 TA-Fe/ART@ZIF는 명백한 기존 코어-쉘 구조를 보여주었으며 TA-Fe 멤브레인의 크기는 약 30nm였습니다(그림 3a). 또한, 형성된 나노 입자의 면적-원소 매핑 분석을 수행했습니다. 면적-원소 매핑은 TA-Fe/ART@ZIF 나노 입자의 주변이 Fe 원소로 둘러싸여 있음을 확인하여 Fe(II)와 TA가 성공적으로 은폐되었음을 나타냅니다(그림 3b). XPS 측정은 TA-Fe/ART@ZIF 합성물의 표면 원소 조성과 상호작용을 조사하기 위해 수행되었습니다. TA-Fe/ART@ZIF의 와이드 스캔 XPS 스펙트럼은 추가 파일 1:그림 1s에 설명되어 있습니다. 약 285, 408, 531, 737 및 1036eV에서 나타나는 주요 피크는 각각 C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p 및 Zn 2p와 관련되어 TA-Fe/ART@ZIF 나노복합체의 형성을 보여줍니다. . 또한 TA-Fe/ART@ZIF의 EDS 매핑 이미지는 추가 파일 1:그림 2s에 나와 있습니다. 탄소(C), 질소(N), 산소(O), 철(Fe), 아연(Zn)과 같은 원소에 해당하는 피크가 XPS 스펙트럼과 잘 일치함을 분명히 알 수 있습니다. Fe(II)의 양을 늘림으로써 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 유체역학적 직경이 증가함을 발견했습니다(추가 파일 1:그림 3s). 코팅을 추가로 확인하기 위해 다양한 나노 입자의 제타 전위를 측정했습니다. ART@ZIF 입자의 형성 TA-Fe(II) 층은 TA의 산성 특성으로 인해 표면 제타를 + 21 mV 전위에서 - 19.5 mV로 이동시켰습니다(추가 파일 1:그림 4s). 이전 문헌[30]에서 보고된 바와 같이 TA 구조의 풍부한 폴리페놀 그룹은 기판 코팅 능력을 부여할 뿐만 아니라 전이 금속 이온(Fe, Zn)과 배위하여 금속-페놀 복합체를 형성할 수 있습니다. Zn 2+ 일 때 및 Hmim이 혼합되어 Zn 2+ 질량의 용액을 형성합니다. 이온은 ART@ZIF 입자의 표면에서 조정됩니다. 따라서 ART@ZIF의 제타 전위는 + 21mV입니다. TA의 페놀 그룹(pKa 8.5)은 음으로 탈양성자화되어 양으로 하전된 Zn 2+ 과 상호작용할 수 있습니다. , ART@ZIF 표면에서 TA-Fe 필름 성장 촉진. 약물 전달이 담체를 선호하므로 안정성은 의약 적용에 중요한 요소입니다. 나노입자의 안정성은 PBS에 1주일 동안 분산시킴으로써 입증되었다. 추가 파일 1:그림 5s에서 볼 수 있듯이 입자 크기는 연구 시간 경과에 따라 바람직한 크기와 안정성을 나타냅니다.
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아 ZIF-8, ART@ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 TEM 이미지 및 크기 분포. 스케일 바:100nm; ㄴ TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 탄소 및 철 원소 분포. 스케일 바:100nm
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아 pH 7.4 및 5.0에서 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자로부터 ART의 시험관내 방출. ㄴ 0, 12.5, 25, 50 및 100μg/mL에서 MDA-MB-231 세포에서 ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 세포독성. ㄷ 다른 농도에서 TA-Fe/ART@ZIF로 처리된 L929 세포의 생존력. d 0, 25, 50 및 100μg/mL 농도에서 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자로 처리된 MDA-MB-231 세포의 Calcein-AM 염색
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ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자로 처리된 MDA-MB-231 세포에서 DCFH-DA의 형광으로 검출된 ROS 생성
다음으로, TA-Fe/ART@ZIF가 pH 반응성 분해 거동을 갖는지 여부를 연구하기 위해 중성 및 산성 조건에서 나노 입자로부터 ART의 방출을 조사했습니다. 그림 4a와 같이 산성 조건에서 나노 입자는 1시간 이내에 약 58%의 ART를 빠르게 방출할 수 있습니다. 그러나 중성 조건에서 나노입자는 소량의 ART만 천천히 방출할 수 있습니다. 또한, 투석막 외용액을 수산화나트륨으로 처리하는 동안 pH =5.0 그룹의 용액을 수산화나트륨과 반응시켜 상당한 백색 침전물을 생성하였다. 그러나 pH =7.4군에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다.
우리의 가설에 따르면 백색 침전물은 산성 조건에서 나노입자로부터 아연 이온과 알칼리가 해리되어 형성된 수산화아연 침전물이다. 종합적으로, 이 증거는 우리의 나노입자가 산성 조건에서 해리하는 능력이 있음을 성공적으로 보여줍니다.
TA-Fe/ART@ZIF 나노 시스템의 설계에서 TA-Fe(II) 및 ZIF 구조는 종양 미세 환경의 산성 조건에서 둘러싸인 ART 및 Fe(II)를 방출하기 위해 절제됩니다. 세포에서 Fe(II) 수준의 상향 조절은 철 매개 엔도퍼옥사이드 다리의 절단을 통해 ART를 라디칼로 분해하여 페로프토시스의 효과를 현저하게 향상시킵니다. 이에, MDA-MB-231 세포와 L929 세포에 대한 나노시스템의 세포독성을 연구하기 위해 MTT assay를 수행하였다. ART와 비교하여 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 MDA-MB-231 세포에 더 큰 세포독성을 보였고(그림 4b) 정상 세포에 대해서는 낮은 세포독성을 보였다(그림 4c). TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 MDA-MB-231 세포의 활성을 53.9% 억제한 반면, 동일한 농도의 ART는 전체 세포의 24.1%만 억제했습니다. Calcein-AM 염색 실험 결과 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 농도가 증가함에 따라 생존 가능한 MDA-MB-231 세포의 양이 점차적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 4d).
ART는 엔도퍼옥사이드 브릿지의 철 매개 절단에 의해 생성되는 ROS 생성을 통해 항암 활성을 발휘하는 것으로 알려져 있습니다[35, 36]. 따라서 우리는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCHF-DA) 프로브에 의해 ROS 생성을 유도하는 TA-Fe/ART@ZIF의 효율성을 조사했습니다[37]. 그림 5에서 볼 수 있듯이, ART와 TA-Fe/ZIF를 처리한 세포는 처리되지 않은 그룹에 비해 약간 더 강한 형광 신호가 관찰되었으며, 이는 ART 및 Fe(II) 이온이 ROS 생성을 유도할 수 있음을 나타냅니다. 대조적으로, TA-Fe/ART@ZIF 나노 약물에 대한 강한 형광 신호 노출은 ART의 Fe(II) 매개 엔도퍼옥사이드의 절단에 의해 생성되는 원하는 ROS 수율의 증거로서 세포에서 발견됩니다. 세포에서 준비된 나노 시스템은 분해되고 Fe(II)가 축적되어 ROS 생성이 현저하게 향상됩니다. ART 및 그 유도체의 항암 효과는 DNA 손상 반응, 리소좀 매개 이화 과정 대자가포식 및 산화 스트레스에 이르기까지 다양한 세포 과정에 의해 세포자멸사를 유도하는 능력에 기인합니다[13, 35, 38]. 그리고 ART에서 엔도퍼옥사이드 브릿지의 철 매개 절단은 많은 유형의 암세포에서 세포 내 산화 균형에 대한 페로프토시스에 영향을 줄 수 있다고 보고되었습니다[11]. 산화적 불균형에 기초한 페로프토시스의 유도는 Fe(II)의 추가로 더욱 증폭될 수 있습니다. Fe(II)는 ART를 활성화하지만 세포 내 과산화수소와 반응하여 종양 세포에서 ART의 세포 사멸 유도 효과를 향상시키는 Fenton 반응을 통해 하이드록실 자유 라디칼을 생성할 수도 있습니다.
한편, 세포 사멸과 Fe(II)의 역할을 조사하기 위해 철 킬레이트제 데페록사민, 세포자멸사 억제제 Z-VAD-FMK 및 페로프토시스 억제제 ferrostatin-1을 사용하여 이러한 세포를 구출했습니다. 예측한 바와 같이, Fe(II)의 제거제인 데페록사민은 분명히 세포 사멸을 차단할 수 있으며, 이는 Fe(II)의 중요한 역할을 시사합니다. 또한, MDA-MB-231 세포의 생존율은 apoptosis와 ferroptosis inhibitor에 의해 각각 31.4%에서 56.3% 및 76.0%로 유의하게 개선되어(그림 6a), TA-Fe/ART에서 apoptosis와 ferroptosis의 중요성을 강조합니다. @ZIF 나노입자는 세포 사멸을 매개합니다. 또한, 우리는 유세포 분석을 통한 Annexin V-FITC 기반 분석을 사용하여 세포 사멸 정도를 정량적으로 결정했습니다. 결과는 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 MDA-MB-231 세포의 21.8%에서 세포자멸사를 유도할 수 있음을 나타냅니다(추가 파일 1:그림 6s). 이 비율은 ART에 대해 기록된 것보다 높았으며, 이는 세포자멸사가 매개된 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자에 관여하지만 이것이 주요 원인은 아님을 의미합니다.
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아 억제제 DFO(데페록사민), Fer-1(페로스타틴-1) 및 Z-VAD-FMK는 각각 100μg/mL TA-Fe/ART@ZIF 나노입자로 처리된 MDA-MB-231 세포의 생존 능력을 구했습니다. ㄴ ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 MDA-MB-231 세포에서 과도한 MDA에 기여했습니다. ㄷ ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 세포 내 GSH를 소비했습니다. d ART, TA-Fe/ZIF 및 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자를 처리한 MDA-MB-231 세포에서 GPX4 단백질의 발현 수준
ferroptosis의 일반적인 특징은 내인성 지질 과산화입니다[39]. 지질 과산화의 산물인 MDA[40]는 ferroptosis의 정도를 평가하기 위해 조사되었습니다. 결과는 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 대조군보다 약 2.5배 더 높은 MDA 수준을 가짐을 보여주었습니다(그림 6b). 이것은 나노캐리어가 풍부한 Fe(II)의 존재와 이에 상응하는 지질 라디칼 수준의 상승으로 인해 추정되었습니다. 세포의 주요 항산화 성분 중 하나인 세포내 GSH는 ferroptosis와 함께 감소한다[41]. ferroptosis에서 GSH의 역할을 고려하여 TA-Fe/ART@ZIF 나노 입자 처리 후 세포 내 GSH 수준을 평가했습니다. GSH는 비히클 처리된 세포에 비해 유의하게 감소했습니다(그림 6c). 이것은 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자에 의한 ART의 Fe(II) 매개 활성화에 중심을 둔 GSH 및 산화 불균형의 고갈에 대한 강력한 증거를 제공했습니다. 다음으로, GPX4 활성에 대한 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 영향을 이해하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다[42]. 우리는 TA-Fe/ART@ZIF 나노 입자가 ART보다 GPX4 활성을 더 크게 억제한다는 것을 관찰했습니다(그림 6d). 이 데이터는 GSH 고갈의 가장 높은 정도와도 잘 일치했습니다.
우리는 종양이 있는 누드 마우스에서 피하 이종이식 종양을 억제하여 생체 내에서 MDA-MB-231 세포에 대한 나노 입자의 항종양 효능을 평가했습니다. 14일 치료 동안 다른 그룹에 비해 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 Fe(II)-ART 반응을 통한 풍부한 ROS 생성의 결과로 MDA-MB-231 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있습니다(그림 . 7a). 또한, 모든 실험군에서 체중의 유의미한 다양성이 없었으며(그림 7b), 이는 TA-Fe/ART@ZIF의 부작용이 무시할 수 있음을 나타냅니다. 치료 효과를 더 연구하기 위해 14일 동안 치료한 후 종양 및 기타 정상 조직을 H&E 염색으로 검사했습니다. As shown in Fig. 8, TA-Fe/ART@ZIF caused the largest region of cell death in the tumor tissue, while there was no obvious damage and apoptosis in the normal tissues. Overall, these results demonstrated that the TA-Fe/ART@ZIF-mediated therapy not only led to anticancer efficacy, but also have a low level of acute systematic toxicity in the SFT-MB-mediated therapy.
아 Relative tumor volume after treated with treated with PBS, ART, TA-Fe/ZIF, and TA-Fe/ART@ZIF nanoparticles. ㄴ Relative mice body weight of various groups
H&E stains of organs and tumors from various mice groups. Scale bar:50 μm
In summary, ferroptosis provides a potential remedy for TNBC treatments, since it has exclusive advantages to overcome inevitable barriers of the currently prevalent therapy. Here, we designed a ferrous-supply nanocarrier for ART based on TA–Fe(II) coated on the ZIF nanoparticles with ART encapsulated via coordination-driven self-assembly for enhanced ferroptosis. The nano-carrier could be dissolved in the weak acidic microenvironment to release ART and Fe(II), which is further caused a high level of intracellular ROS and MDA, accompanied with decreasing of GSH and GPX4, leading to potent tumor growth inhibition and anticancer efficacy in vitro and in vivo. This work provides a novel approach to enhance the potency of ferroptotic nano-medicine and new directions for TBNC therapy. Biocompatibility and comprehensive mechanisms of TA-Fe/ART@ZIF-induced ferroptosis should be ensured for further investigation.
모든 데이터는 제한 없이 완전히 사용할 수 있습니다.
Metal–organic frameworks
Triple-negative breast cancer
Artemisinin
Tannic acid
Zeolitic imidazolate framework-8
Tannic acid and ferrous ion coated on the zeolitic imidazolate framework-8 with artemisinin encapsulated
활성 산소 종
Lipid hydroperoxides
Glutathione
투과전자현미경
푸리에 변환 적외선 분광기
고성능 액체 크로마토그래피
인산염 완충 식염수
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Deferoxamine
Ferrostatin-1
N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone
Calcein-acetoxymethyl
Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate
Malondialdehyde
소 혈청 알부민
Tris-buffered saline Tween
Polyacrylamide gel electrophoresis
Glutathione peroxidase 4
나노물질
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
양사는 인슐린 의존성 당뇨병의 모니터링 및 치료를 위한 최초의 완전한 IoT 건강 솔루션인 Actiste를 도입했습니다. Ericsson과 스웨덴 건강 기술 회사 Brighter는 당뇨병에 대한 새로운 치료법인 Actiste를 만들기 위해 협력했습니다. 인슐린 의존성 당뇨병을 모니터링하고 치료하도록 설계된 최초의 IoT 기반 솔루션입니다. 현재 120만 명이 당뇨병을 앓고 있는 UAE에서 사용 가능하며 회사는 이를 전 세계적으로 사용할 수 있기를 희망합니다. Brighter AB CEO인 Henrik Norström은 다음과
