AS1411 압타머 기능화 산화환원 반응성 젤라틴/실리카 나노겔: 표적 siRNA 전달용

요약

RNA 간섭(RNAi)은 유전자 침묵에 비교할 수 없는 특이성을 제공하지만, siRNA 안정성과 정밀한 조직 전달이 제한 요소로 남아 있습니다. 우리는 디설파이드 링커를 통해 뉴클레오린 표적 AS1411 압타머와 탈옥시뉴클레오타이드 치환 siRNA를 젤라틴 기반 나노겔(GS)에 접합하여 이중 반응성 시스템을 설계했습니다. 이 설계는 siRNA의 일시적 도킹을 허용하고, 글루타티온 풍부 종양 미세환경에서 방출을 유도합니다. 뉴클레오린 양성 A549 세포에서 Apt-GS/siRNA 나노겔은 세포내 GSH 노출 시 분해되어 siRNA를 세포질로 효율적으로 전달하고 강력한 루시페라제 녹다운을 달성합니다. 세포독성 분석은 치료 관련 농도에서 생체적합성을 확인했습니다. 이러한 산화환원 반응성, 종양 표적 나노겔은 siRNA 기반 암 치료를 위한 유망한 플랫폼입니다.

서론

RNAi는 서열 특이적 유전자 침묵을 활용하여 정밀성과 낮은 독성으로 유전 질환, 암, 감염성 질환 치료의 선두 후보로 자리잡았습니다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 비해 작은 간섭 RNA(siRNA)는 향상된 뉴클레아제 저항성을 보입니다. 리보뉴클레오타이드를 탈옥시뉴클레오타이드로 치환하는 화학적 변형은 RNAi 활성의 ~40%를 유지하면서 siRNA 안정성을 높이는 것으로 나타났습니다. 이러한 발전에도 불구하고 효율적이고 조직 특이적 전달은 여전히 난제입니다.

나노입자 캐리어는 siRNA를 분해로부터 보호하고 표적 전달을 촉진할 수 있습니다. 많은 증식 암세포 표면에서 과발현되는 뉴클레오린은 종양 특이적 섭취를 위한 매력적 표적입니다. G-사중나선 DNA 압타머 AS1411(AGRO100)은 뉴클레오린에 높은 친화력으로 결합하며 항암제로 2상 임상시험에 진입했습니다. 이전 연구들은 AS1411을 다양한 나노물질에 접합하여 선택적 종양 세포 내재화를 달성했습니다. 젤라틴은 우수한 생체적합성과 겔화 특성으로 siRNA 캡슐화에 사용되어 왔습니다. 우리 그룹은 이전에 조절된 크기와 표면 전하를 가진 실록산 가교 젤라틴 나노겔(GS NGs)을 개발하여 in vitro와 in vivo에서 효율적 형질전환을 입증했습니다.

세포내 장벽, 특히 엔도솜 탈출과 siRNA 방출 극복이 중요합니다. 종양 세포의 높은 글루타티온(GSH) 환경에서 절단되는 디설파이드 결합 같은 자극 반응성 연결자가 큰 관심을 끌었습니다. 디설파이드 가교 캐리어는 악성 세포 내에서 치료 탑재물의 폭발적 방출을 유도할 수 있습니다.

여기서 우리는 GS NGs, AS1411 압타머 표적화, 산화환원 유발 siRNA 방출용 디설파이드 링커를 결합한 하이브리드 나노겔 시스템을 제시합니다. 세포 섭취 향상, 종양 특이적 유전자 침묵 달성, 낮은 세포독성 유지 능력을 평가했습니다.

방법

재료

젤라틴(Bloom 240-270, pH 4.5-5.5)은 BBI Company Inc.(미국) 제품. SPDP, GPSM, APTMS는 Sigma-Aldrich(미국) 제품. MTT, DMEM, FBS, 페니실린, 스트렙토마이신은 Hyclone(미국) 제품. AS1411, 5'-FAM-AS1411, 음성 대조군 TDO는 Sangon Biotech(중국) 합성. 탈옥시뉴클레오타이드 치환 Luc-siRNA(센스 가닥: 5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'; 안티센스 가닥: 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'; FAM-라벨 안티센스)는 Gene Pharma(중국) HPLC 정제. Lipofectamine 2000, 루시페라제 플라스미드 pGL3, 루시페라제 분석 시스템은 Promega(미국) 제품. A549 폐선암 세포와 NIH 3T3 섬유아세포는 샤먼 대학교 생체의공학센터(중국) 제공. 모든 시약 분석 등급; 유리기구 철저 세척 후 탈염수 헹굼.

사용 DNA 서열:

• AS1411 압타머: 5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3'
• 대조 TDO: 5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Apt-GS/siRNA 복합체 제조 및 특성 분석

GS 나노겔은 졸-겔 공정으로 합성: GPSM (0.2 g)을 0.75% 젤라틴 20 mL (HCl, pH 3)에 60 °C에서 30분 첨가, 이후 APTMS (0.08 g) 첨가 24시간 배양. 결과 GS NGs를 원심분리(14,000 rpm, 25 °C, 12분) 3회 정제. 다음, GS NGs (0.5 mL, 5 g L⁻¹ PBS)를 SPDP (25 µL, 20 mM DMSO)와 실온 60분 반응, 이후 티올화 AS1411 (1 mg mL⁻¹)과 12시간 배양. Apt-GS 나노겔을 원심분리 회수 후 탈염수 3회 세척. SPDP 활성화 Apt-GS NG 현탁액 (80 mL, 5 mg mL⁻¹)을 siRNA 센스 가닥과 4 °C에서 하룻밤 혼합. 정제 후 안티센스 가닥을 94 °C 5분 가열 후 47 °C 20분 냉각으로 어닐링하여 Apt-GS/siRNA 복합체 형성.

투과 전자 현미경(TEM, Hitachi S-4300)은 구형 입자 확인. 동적 광산란(Malvern Zetasizer)으로 수동적 직경과 제타 전위 측정. 접합 효율은 FAM-라벨 DNA 형광과 닌히드린 분석으로 표면 아미노기 정량(≈0.642 mmol g⁻¹).

젤 전기영동 분석

전기영동은 TBE 버퍼 2% 아가로스 겔에서 100 V, 20-30분 수행. 겔 문서화 시스템으로 이미지 촬영. 방출 연구 위해 GS/siRNA, Apt-GS/siRNA 복합체를 10 mM GSH (PBS) 2시간 배양 후 로딩.

In Vitro 세포독성

A549 세포(1×10⁴ cells/well) 96-웰 플레이트에서 MTT 분석. 24시간 후 70% 컨플루언시 도달 시 나노겔(100-600 µg mL⁻¹) 무혈청 DMEM 24시간 처리, 이후 MTT (5 mg mL⁻¹) 4시간 배양. DMSO 첨가 후 490 nm 흡광도 측정. 3회 반복; 생존율(%)은 무처리 대조군 대비 계산.

세포 내재화

A549, 3T3 세포를 FAM-라벨 Apt-GS 또는 TDO-GS (2 mg mL⁻¹) 25 µL와 무혈청 배지 37 °C 10시간 배양. 4% 파라포름알데히드 고정 후 공초점 레이저 현미경(CLSM) 이미징. 유세포 분석 위해 FAM-라벨 나노겔 (2 mg mL⁻¹) 0.5-16시간 처리 후 세척, 얼음 PBS 재현탁, EPICS XL 유세포계 분석. 섭취 저해는 자유 AS1411 (0.5, 5, 50 µM) 8시간 사전 배양 후 나노겔 첨가로 평가.

유전자 침묵

A549 (2×10⁵ cells/well), NIH 3T3 (4×10⁵ cells/well) 세포를 Apt-GS/siRNA 복합체 (80 µg mL⁻¹) 8시간 형질전환. 세 처리 체계 평가: (a) Apt-GS/siRNA 단독; (b) Apt-GS/siRNA 후 리포솜 (A-GS/si→Lip); (c) 동시 Apt-GS/siRNA 및 리포솜 (A-GS/si+Lip). 추가 40시간 후 루시페라제 활성 측정 (루시페라제 분석 시스템). 데이터는 평균 ± SEM (3회 반복) 제시.

결과 및 토의

GS-AS1411/siRNA 복합체 합성 및 특성

TEM 이미지(Fig. 1)는 빈 GS와 Apt-GS 나노겔 모두 170-200 nm 직경의 균일한 구형 입자 형성 확인. 형광 이미징으로 AS1411과 siRNA 성공적 접합 입증. 정량화로 GS 상 ~0.65 µmol g⁻¹ 압타머 확인. 수동적 크기: GS 162.3 nm → Apt-GS 216.5 nm → Apt-GS/siRNA 234.9 nm로 표면 기능화 반영. 제타 전위: GS +40.1 mV → Apt-GS +33.9 mV → Apt-GS/siRNA -24.9 mV로 표면 전하 감소가 비특이적 단백질 결합과 세포독성 저하 예상.

siRNA 로딩 및 방출

젤 전기영동은 Apt-GS/siRNA 복합체로 효율적 siRNA 로딩 확인(레인 10-11 이동도 감소). 10 mM GSH 배양 시 2시간 내 siRNA 방출(레인 6-7), 산화환원 유발 분해 확인. 로딩 용량 3:1 ~ 2:1 pmol siRNA/µg 나노겔 추정. 물리적 포집(자유 siRNA와 GS 혼합)은 더 약한 유지력 보이며 공유 결합 이점 강조.

세포독성 및 뉴클레오린 표적화

MTT 분석(Fig. 4)은 GS, Apt-GS, Apt-GS/siRNA 모두 100-600 µg mL⁻¹에서 >80% 생존율로 우수한 생체적합성 입증. Apt-GS 약간 생존율 감소는 AS1411 유도 NF-κB 억제와 소기관 파괴 기인. 형광 현미경과 유세포 분석(Figs. 5, 6) 선택적 섭취 확인: Apt-GS A549 세포 96% vs 3T3 섬유아세포 52% 내재화. 자유 AS1411 경쟁으로 섭취 50%(형광), 30%(양성 세포 비율) 감소, 뉴클레오린 매개 내포작용 확인.

RNA 간섭

루시페라제 녹다운 분석(Fig. 7a) Apt-GS/siRNA로 A549 세포 4.6배 감소, NIH 3T3 세포만 6% 감소로 종양 특이성 강조. 리포솜 추가(A-GS/si→Lip)는 Apt-GS/siRNA 단독(30.4%) 대비 유의적 향상 없음, 반면 동시 리포솜 처리(A-GS/si+Lip)는 41.6%로 녹다운 증가. 최고 침묵(3T3 대비 ≈2.7배)은 80 µg mL⁻¹에서 달성, 120 µg mL⁻¹에서 세포독성 증가로 효율 감소.

결론

탈옥시뉴클레오타이드 변형 siRNA를 보호하고 GSH 풍부 종양 세포질에서 특이적으로 방출하는 산화환원 반응성, 뉴클레오린 표적 나노겔 플랫폼을 설계했습니다. ~200 nm, 양전하 Apt-GS/siRNA 나노겔은 낮은 세포독성 유지하며 강력하고 종양 선택적 유전자 침묵(~A549 세포 5배 향상) 달성. 이 결과는 디설파이드 링커 화학과 압타머 표적화 결합 전략이 효율적 siRNA 전달에 유효함을 검증하며, 임상 RNAi 치료제로의 유망한 단계를 나타냅니다.