RNA 간섭(RNAi)은 높은 특이성과 표적 유전자 발현을 억제하는 능력으로 인해 다른 유전자 치료법에 비해 잠재적인 이점이 있습니다. 그러나 siRNA의 안정성과 조직 특이적 전달은 RNAi 치료제의 가장 큰 장애물로 남아 있습니다. 여기에서 우리는 젤라틴 기반 나노겔을 뉴클레오린 표적 AS1411 앱타머 및 디옥시뉴클레오티드 치환 siRNA(Apt-GS/siRNA)와 함께 이황화물 링커를 통해 접합하여 siRNA의 일시적인 도킹을 달성함으로써 이러한 시스템을 개발했습니다. 이러한 Apt-GS/siRNA 나노겔은 이황화물 절단으로 인해 환원 조건에서 siRNA의 유리한 방출을 입증했습니다. 또한, 이 스마트 시스템은 글루타티온에 의해 유발된 분해 및 루시퍼라제에 대한 효율적인 RNAi에 의해 뉴클레오린 양성 세포(A549)의 세포질 내로 siRNA를 선택적으로 방출할 수 있습니다. 게다가, 이황화물이 장착된 Apt-GS 나노겔은 시험관 내에서 우수한 생체 적합성을 보였다. 종합하면 이 산화환원 반응성 종양 표적 스마트 나노겔은 기능화된 siRNA 전달 및 종양 치료를 활용하는 데 큰 잠재력을 보여줍니다.
RNA 간섭(RNAi)은 유전자의 염기서열 특이적 침묵(sequence-specific silencing)이며, 높은 특이성과 낮은 독성으로 인해 유전질환, 암, 전염병 등 광범위한 질병의 치료에서 현재 가장 유망한 방법으로 평가되고 있습니다. [1]. 이중 가닥 RNA 분자가 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)는 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 뉴클레아제 분해에 더 저항력이 있으므로 안티센스 요법에 비해 이점을 나타냅니다. 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 siRNA에 통합하여 RNAi의 효능 및 지속 시간을 증가 또는 감소시켰다. 센스 가닥의 리보뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 교체하면 센스 가닥의 안정성을 증가시키고 RNAi의 약 40% 효능을 유지할 수 있음이 입증되었습니다[2, 3]. 그러나 siRNA의 조직 특이적 전달은 시험관 내 연구[4, 5]에서 관찰된 큰 유전자 녹다운 효능에도 불구하고 그 적용에 큰 장애물로 남아 있습니다.
나노입자 기반 전달은 효과적인 siRNA 안정화 및 부위 특이적 전달을 위한 추가 변형에 잠재적인 이점이 있습니다[6,7,8]. siRNA의 생산적인 부위 지정 전달은 대부분의 실제 응용에서 요구되는 형질감염을 향상시키고 표적외 효과를 감소시킬 수 있습니다[9]. 뉴클레올린은 다양한 생물학적 과정과 관련되어 있으며 다양한 정상 세포의 핵 및 세포질에서 격렬하게 발현됩니다. 또한, nucleolin은 정상 세포에 비해 활발하게 증식하는 암세포의 원형질막에서 높게 발현되므로 종양 치료의 매력적인 표적으로 사용됩니다. G-quartet DNA 앱타머인 Aptamer AS1411(AGRO100이라고도 함)은 2상 임상시험에 도달한 핵인자-kB 필수 조절제와 결합하여 세포 표면의 뉴클레올린과 강력하게 결합하여 암세포의 항아폽토시스 경로를 차단할 수 있습니다. 인간의 암 치료를 위한 최초의 핵산 압타머 약물[10, 11]. 지금까지 AS1411은 다양한 나노입자에 성공적으로 접합되어 암세포에 내재화되었다[12,13,14,15]. 젤라틴은 우수한 생체 적합성, 생분해성 및 겔화 특성으로 인해 siRNA 캡슐화에 사용되었습니다[16,17,18]. 우리 그룹은 크기와 표면 전하가 제어된 일련의 실록산-가교 젤라틴 나노겔(GS NG)을 조사하여 시험관 내 및 생체 내에서 GS NG의 형질감염 효율을 입증했습니다[19, 20].
세포내 장벽 외에도 siRNA의 효율적인 분해 및 엔도솜 탈출을 포함하는 내재화 후 세포내 장벽은 똑같이 도전 과제로 남아 있습니다. 불안정하거나 불안정한 결합을 통해 운반체에 siRNA를 접합하는 것은 이러한 전달 문제를 극복하기 위한 유망한 방법입니다. 산성 pH 및 산화환원 전위에서 자극 반응 방출은 큰 관심을 받았습니다. 이황화물 교차 결합은 세포외 환경에서 더 높은 글루타티온(GSH) 수준으로 인해 종양 세포에서 절단된 결합을 통해 약물 방출의 폭발적인 가능성을 표시합니다[21, 22]. 이황화 결합을 통해 형성된 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)/siRNA 접합체는 향상된 캡슐화 및 전달 효율을 나타내는 것으로 보고되었습니다[23].
이 연구에서, 이황화물 접합의 산화환원 반응성의 이중 기능과 압타머 AS1411의 특정 종양 표적화의 이중 기능을 갖는 GS 기반 하이브리드 나노겔이 암 치료를 위한 siRNA 운반체로서 탐구되었습니다(도식 1). 우리는 AS1411 기능적 GS NG가 효과적인 세포 내재화를 개선하고 시험관 내에서 루시페라제 모델 유전자의 종양 특이적 유전자 침묵을 달성하는지 여부를 조사하는 것을 목표로 합니다. 또한, 이 시스템의 안전성도 시험관 내에서 평가되었습니다.
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산화 환원 반응 및 종양 표적화 Apt-GS NG는 이황화물 접합 및 압타머 AS1411을 사용한 siRNA 전달을 위해 개발되었습니다.
젤라틴(꽃 번호:240-270, pH 4.5-5.5)은 BBI Company Inc.(미국)에서 구입했습니다. 아니 -숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPSM) 및 3-아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)은 Sigma-Aldrich Co.(미국)에서 구입했습니다. 3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Amresco Co.(미국)에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 태아 소 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신은 Hyclone Co.(USA)에서 입수했습니다. AS1411 앱타머, 5'-FAM-표지된 AS1411 및 음성 대조군 DNA(TDO)는 Sangon Biotech Co.(중국)에 의해 합성되었습니다. Luc-siRNA의 티올 센스 가닥, 5'-SH-(CH2 )6 -CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'(리보뉴클레오티드를 대체하는 데옥시뉴클레오티드) 및 안티센스 가닥, 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5' 및 3' 말단의 FAM 표지 안티센스 가닥을 Gene Pharma Co.에서 합성하고 HPLC로 정제했습니다. 중국). Lipofectamine 2000, luciferase plasmid pGL3, luciferase assay system은 Promega Co.(USA)에서 구입하였다. 악성 인간 폐 선암종 A549 세포 및 정상 NIH 3T3 섬유아세포가 사용되었고 Xiamen University(중국)의 Biomedical Engineering Center에서 제공되었습니다. 사용된 모든 재료는 분석 등급이었고 추가 정제가 없었습니다. 유리 제품을 철저히 세척하고 탈이온수로 헹굽니다.
DNA 서열은 다음과 같습니다:
AS1411 앱타머:5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3', 대조군 TDO:5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'
아미노 기능화된 젤라틴/실리카 나노겔(GS NG)은 이전에 설명한 대로 졸-겔 절차에 의해 먼저 제조되었습니다[19]. 일반적으로 GPSM 0.2g을 60°C의 HCl 용액(pH =3)에 녹인 0.75% 젤라틴 용액 20 mL에 30분 동안 교반한 다음 APTMS 0.08g을 추가하고 24시간 더 인큐베이션합니다. 얻어진 GS NG를 3회 원심분리(14,000 rpm, 25 °C, 12 min)하여 정제하였다. 둘째, GS NG(0.5 mL, PBS 중 5 g/L)를 실온에서 60분 동안 25uL SPDP(DMSO 중 20 mM)로 처리한 다음 티올화 AS1411(1 mg/mL)을 첨가하고 12 h. Apt-GS 나노겔은 원심분리(14,000 rpm, 25 °C, 12 min)에 의해 얻어지고 탈이온수로 세 번 정제되었습니다. 세 번째로, 얻어진 SPDP 활성화 Apt-GS NG 현탁액(80 mL, 5 mg/mL)을 4 °C에서 밤새 siRNA 센스 가닥과 직접 혼합했습니다. 원심분리로 정제한 후 siRNA 안티센스 가닥을 추가하고 94 °C에서 5분 동안 배양한 다음 47°C에서 20분 동안 어닐링하여 Apt-GS/siRNA 복합체를 형성했습니다.
AS1411-GS 및 AS1411-GS/siRNA 복합체의 표면 형태를 투과전자현미경(TEM)(Hitachi S-4300, Japan)으로 조사하였다. 각 샘플의 입자 크기 및 제타 전위는 Nano-ZS Zetasizer 동적 광산란 검출기(Malvern Instruments, UK)로 측정되었습니다. 유효 입자 직경은 로그 정규 분포를 가정하는 Malvern Zetasizer 소프트웨어를 사용하여 자기 상관 함수로부터 계산되었습니다. GS와 AS1411 또는 siRNA의 접합은 F-7000 형광 현미경(Olympus-IX73, Japan)을 사용하여 부착되지 않은 FAM-표지된 DNA의 농도를 수집하고 측정하여 결정하였다. 총 아미노 그룹(-NH2 ) 닌히드린 비색 반응을 이용하여 GS 나노겔 표면의 수준을 정량적으로 측정하였다. 그 양은 약 0.642 mmol/g이었다.
겔 전기영동은 TBE 완충액에 2%(w/v) 아가로스 겔을 사용하여 100 V에서 20-30분 동안 수행되었습니다. 겔 문서화 시스템(Tanon GIS-2008, China)으로 조사하여 이미지를 관찰하였다. Apt-GS/siRNA 캡슐화 분석에서, 네이키드 siRNA, GS/siRNA 및 Apt-GS/siRNA 복합체가 첨가제 없이 겔에 로딩되었습니다. 산화환원 반응 분석에서 GS/siRNA 및 Apt-GS/siRNA 복합체는 측정 전에 PBS에서 10 M GSH 용액과 함께 2 시간 동안 배양되었습니다.
인간 폐 선암 A549 세포에 대한 세포독성을 MTT 분석으로 평가하였다. 간단히 말해서, A549 셀(1 × 10 4 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 배양 플레이트에 접종하고 70% 합류가 될 때까지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 제거한 후, 나노겔(100–600 mg/mL)이 포함된 무혈청 DMEM 배지 100μL를 각 웰에 첨가했습니다. 배지를 처리한 세포는 음성 대조군으로만 작용하였다. 24시간 공동 인큐베이션 후, 20μL의 MTT 용액(PBS 완충액 중 5mg/mL)과 함께 100μL의 새로운 배지를 첨가하고 또 다른 4시간 동안 배양했습니다. 그런 다음, MTT 용액을 제거하고 100 ㎕의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하였다. 암실에서 30분 동안 진동시킨 후 각 웰의 흡광도를 490nm 파장에서 micro-plate reader(TECAN DNA export, Swiss)로 측정하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었습니다. 상대 세포 생존율(%)은 처리되지 않은 대조군 세포에 대한 백분율로 표시되었습니다.
세포를 37 °C에서 무혈청 배지에서 10 시간 동안 25 μL의 FAM 표지 Apt-GS 및 TDO-GS 나노겔(2 mg/mL)과 함께 배양합니다. PBS로 3회 세척한 후 세포를 파라포름알데히드(PBS 중 4%)로 30분 동안 고정한 후 공초점 레이저 주사현미경(Leica, Germany)으로 관찰하였다. 세포 흡수를 정량화하기 위해 세포를 37°C에서 무혈청 배지에서 일정 기간(0.5–16 h) 동안 FAM 표지 AS1411-GS 및 TDO-GS(2 mg/mL) 25μL로 처리했습니다. Apt-GS NG의 세포 흡수에서 뉴클레올린의 역할을 평가하기 위해 준비된 Apt-GS NG와 다양한 농도(0.5, 5, 50μM)의 유리 AS1411 앱타머의 혼합물을 A549 세포와 함께 8시간 동안 배양했습니다. 시간. 그런 다음, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하고 EPICS XL 유세포 분석기(Beckman Coulter, USA)를 사용하여 10,000개 세포에서 FAM으로 표지된 나노겔을 포함하는 형광 세포를 계산했습니다. 데이터 분석은 EPICS XL 유세포 분석기 소프트웨어로 수행되었으며 분석 게이트는 양성 영역에 속하는 대조군 세포의 1%로 선택되었습니다.
유전자를 침묵시키는 능력은 루시퍼라제용 siRNA와 루시퍼라제 발현 세포의 조합을 사용하여 조사되었다. 간단히 말해서, 루시페라제 발현 A549(2 × 10 5 세포/웰) 및 NIH 3 T3 섬유아세포(4 × 10 5 세포/웰)을 12웰 플레이트에 파종하고 밤새 배양한 다음 LUC-siRNA(또는 대조군 siRNA)를 포함하는 100μL의 테스트 복합체(80μg/mL)로 8시간 동안 처리했습니다. 샘플을 세 그룹으로 나누었습니다:(a) 8시간 동안 Apt-GS/siRNA 복합체만, (b) 8시간 동안 Apt-GS/siRNA 복합체에 이어 추가 1시간 동안 리포솜(A-GS/si→ Lip 그룹), 및 (c) Apt-GS/siRNA 복합체와 리포솜을 8시간 동안 공동 배양(A-GS/si+Lip 그룹). 처리하지 않은 세포와 루시페라제 플라스미드 pGL3(Madison, WI, USA)으로 형질감염된 세포를 대조군으로 하였다. 추가 40시간 배양 후, 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 세포에서 루시퍼라제 발현을 정량화하여 유전자 녹다운 효율을 조사했습니다. 실험은 3회 수행되었으며 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다.
암을 표적으로 하는 siRNA 운반체를 만들기 위해 졸겔법을 사용하여 젤라틴/실리카-AS1411(Apt-GS) 나노겔을 설계하였다(Scheme 1)[19, 20]. 일반적인 TEM 이미지(그림 1)는 블랭크 GS와 Apt-GS가 평균 직경이 170–200 nm인 분산된 구형 구조임을 보여줍니다. FAM으로 표지된 DNA를 합성에 사용하여 AS1411과 siRNA가 GS NG에 결합되었는지 확인했습니다. 형광 스펙트럼을 사용하여 정량화한 GS 상의 접합된 압타머의 양은 약 0.65μmol/g이었습니다. 한편, 형광 이미지에서 강렬한 녹색 형광을 쉽게 관찰할 수 있어 앱타머 AS1411과 siRNA의 통합을 시사한다. 그림 2에서 보는 바와 같이, 베어 GS, Apt-GS, Apt-GS/siRNA NG(각각 162.3 nm, 216.5 nm, 234.9 nm)의 유체역학적 크기는 표면 기능층. 반면에 Apt-GS의 제타 전위는 표면의 음성 DNA 앱타머의 마스킹 효과로 인해 베어 GS NG(40.1 ± 0.5 mV)보다 양성(33.9 ± 0.5 mV)이 낮았다. 표면에서 siRNA와의 추가 접합 후, Apt-GS/siRNA NG의 제타 전위는 siRNA의 과잉 유리 음성 포스페이트 그룹으로 인해 여전히 24.9 mV로 음으로 이동합니다. 이 결과는 강한 양전하가 혈액의 음전하를 띤 단백질을 방해하고 세포막을 파괴할 수 있기 때문에 생물학적 독성이 감소했음을 시사합니다[24].
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Apt-GS의 이미지(a , ㄷ ) 및 Apt-GS/siRNA 나노겔(b , d ). 아 , b TEM 이미지. 눈금 막대는 0.5 μm를 나타냅니다. ㄷ , d 형광 이미지. 눈금 막대는 5 μm
를 나타냅니다. <그림>
GS, Apt-GS 및 Apt-GS/siRNA 나노겔의 유체역학적 크기 및 제타 전위
성공적인 RNAi는 siRNA가 운반체에서 세포질로 빠르게 전달 및 방출될 때만 발생할 수 있습니다[25]. 종양 세포는 정상 세포보다 7-10배 더 높은 GSH 농도를 갖는다[26, 27]. 이 연구에서 siRNA는 이황화 가교 반응을 통해 활성 Apt-GS NG에 접합되었습니다. Apt-GS/siRNA 복합체의 siRNA 로딩 및 방출 능력을 평가하기 위해 젤 전기영동(GE)을 수행했습니다. 예상대로 유리 pDNA(그림 3, 레인 1-5)가 일반적인 위치로 이동하는 동안 Apt-GS/siRNA 복합체는 전기 이동성 이동 분석(그림 3, 레인 10-11)에서 감소된 이동성을 나타내어 좋은 결과를 보여주었습니다. siRNA 로딩. 세포 내 조건을 모방하기 위해 10 mM의 GSH를 2 시간 동안 복합체로 처리하여 Apt-GS/siRNA NG를 감소시켰습니다. 그림 3, 레인 6-7에서 볼 수 있듯이, GSH 처리 후 폴리아크릴아미드 겔에서 siRNA 분자가 관찰되었으며, 이는 Apt-GS/siRNA NG가 글루타티온의 존재 하에서 이황화물 절단에 의해 기능적 siRNA 분자를 가역적으로 방출할 수 있음을 나타냅니다. 또한, 2% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 siRNA와 대조군 siRNA의 총량을 비교하여 나노입자 상의 siRNA의 양을 분석하였다. Apt-GS는 마이크로그램당 3:1~2:1 pmol의 비율로 siRNA 분자를 캡슐화했습니다. 또한 siRNA와 Apt-GS의 혼합물은 음성 siRNA의 물리적 포획으로 인해 더 약한 머무름을 나타냈다(그림 3, 레인 8).
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Apt-GS 나노겔에 대한 siRNA 가역적 결합의 AGE 분석. 레인 1–5:50, 40, 30, 20 및 10 pmol의 양이 있는 유리 siRNA. 레인 6 및 7:2 h에서 10 mM GSH가 있는 GS/siRNA 및 Apt-GS/siRNA. 레인 8:유리 siRNA와 Apt-GS NG의 혼합물. 레인 10 및 11:대조군으로서 10 mM GSH가 없는 GS/siRNA 및 Apt-GS/siRNA 복합체
시험관 내 세포 독성 평가는 A549 세포에서 MTT 분석에 의해 조사되었습니다. MTT 분석은 제조된 나노겔의 세포독성을 평가하는 데 사용됩니다. 무독성 luciferase siRNA가 리포터로 선택되었으며 이는 종양 세포에 대한 사멸 효과가 없습니다[28, 29]. 따라서 세포 생존력은 담체의 생체 적합성을 나타냅니다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 100–600 μg/mL 농도에서 GS, Apt-Apt, Apt-Apt/siRNA에 의해 세포 증식에 큰 영향을 미치지 않았으며(cell viability> 80%), 세포독성이 나타났습니다. -매달린. 베어 GS NG와 비교하여 AS1411-변형된 나노겔은 NF-κB 신호 전달의 억제 [27, 30] 및 세포 소기관 막의 파괴 [16]로 인해 세포 생존력이 약간 감소했습니다. Apt-GS 나노겔의 양성 생체 적합성은 생체 내 siRNA 운반체로 적합합니다.
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MTT 분석으로 측정된 다양한 농도의 GS, Apt-GS 및 Apt-GS/siRNA 나노겔을 사용한 A549 세포의 세포 생존율
시험관 내 종양 세포에서 Apt-GS의 표적화를 평가하기 위해 우리는 A549 세포와 3T3 섬유아세포를 동일한 양의 FAM 표지 Apt-GS 또는 대조군 TDO-GS(대조군 올리고뉴클레오티드로 장식된 GS)와 함께 배양했습니다. 낮은 수준의 형광은 3T3 세포에서 또는 세포가 대조군 TDO-GS로 처리되었을 때 관찰될 수 있었습니다(그림 5b, c). 대조적으로, 압타머 AS1411에 의해 방출되는 녹색 형광은 A549 암세포에서 현저하게 향상되어(도 5a), 이는 Apt-GS가 뉴클레올린 표적 AS1411 압타머의 도입으로 인해 종양 세포에 특이적으로 축적되었음을 시사한다. 유세포 분석에 의한 정량 분석(그림 6)에서 Apt-GS NG는 두 세포 유형 모두에서 시간 의존적 형광 강도를 나타냈다. A549 세포와 3T3 세포에서 Apt-GS의 내재화의 0.5에서 16 h 형광 강도는 각각 13배와 2배 향상되었습니다. NG를 포함하는 세포 비율은 처음 30분에 급격히 증가했으며 A549에서 8시간에 가능한 최대 포화도가 분명히 최대였습니다. 관찰되었다. 나노겔의 세포 흡수에서 뉴클레올린의 역할을 평가하기 위해 다양한 농도(0.5, 5, 50μM)의 제조된 Apt-GS NG와 유리 AS1411 앱타머의 혼합물을 A549 세포와 함께 8시간 동안 인큐베이션했습니다. 세포막에서 발현된 뉴클레올린에 대한 Apt-GS NG와 경쟁하기 위해 유리 AS1411 앱타머를 사용할 때 나노겔을 함유하는 세포의 형광 강도 및 백분율이 각각 50% 및 30% 감소하여 뉴클레오린 유도 수용체 매개 엔도사이토시스를 시사한다. 도 6c). 이 데이터는 Apt-GS NG가 뉴클레올린 매개 내재화를 통해 A549 암세포에서 더 높은 축적을 나타냄을 보여주었습니다.
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아 –ㄷ Apt-GS 및 TDO-GS 나노겔에 의해 전달되는 FAM-siRNA의 세포 흡수. 이미지는 CLSM으로 촬영되었습니다. 녹색 신호:FAM. 눈금 막대는 10 μm
입니다. <그림>
다양한 세포 유형에서 FAM으로 표지된 Apt-GS 및 TDO-GS 나노겔의 세포 흡수에 대한 유세포 분석(FCMS). 삽입:FACS 프로필, a , b 곡선 빨간색, 녹색, 파란색, 보라색, 물색 및 노란색은 0.5~16 h의 잠복기를 나타냅니다. ㄷ 곡선 빨간색, 녹색, 파란색 및 보라색은 0에서 16 μM
까지의 AS1411 농도를 의미합니다.
deoxynucleotides를 siRNA에 통합하면 센스 가닥의 안정성을 증가시키고 RNAi의 약 40% 효능을 유지할 수 있다고 보고되었습니다[2, 3]. 테스트 siRNA 운반체의 녹다운 효율을 평가하기 위해 우리는 두 세포 모두에서 리보뉴클레오티드로 대체된 루시퍼라제 리포터 유전자 시스템을 사용했습니다. siRNA의 유전자 녹다운(KD) 효율은 48시간 후 루시퍼라제 활성을 통해 평가되었습니다. 도 7a에 도시된 바와 같이, Apt-GS/siRNA는 정상 3T3 세포의 6%에 비해 A549 세포의 유전자 녹다운 효율을 4.6배 향상시켜 우수한 세포 선택성을 나타낸다. 이는 압타머 AS1411 변형이 표적화 효과를 발생시켜 형질감염 효율을 향상시켰음을 시사한다. 양이온성 리포좀은 화물 운송을 돕고 리소좀으로부터 탈출하는 것으로 입증되었습니다[31]. 또한, 리포솜의 후속 첨가(A/si-GS →Lip 그룹)는 이황화물 절단에 의한 글루타티온(GSH) 세포 내 환경에서 siRNA 방출을 유추하여 엔도솜 파괴에도 불구하고 siRNA 매개 유전자 억제 활성(30.4%)을 개선하는 데 도움이 되지 않았습니다. . 게다가, 리포좀과 Apt-GS/siRNA(A/si-GS + Lip 그룹)의 동시 형질감염은 이전 보고서에 상응하여 리포좀 보조 리소좀 탈출을 통해 A549에서 루시페라제 발현의 약간의 녹다운 효율(41.6%)을 개선했습니다[27 , 30]. 그러나 A549 세포는 3T3 세포에 비해 A/si-GS→Lip 그룹과 A/si-GS+Lip 그룹에서 각각 2.7배 및 1.4배의 유전자 억제 활성을 나타내어 세포 선택성의 감소를 추론할 수 있습니다. /P> <그림>
Apt-GS 나노겔에 제형화된 항-루시페라제 siRNA의 시험관내 침묵 효과(a ) 및 유전자 침묵에 대한 Apt-GS/siRNA 복합체(A-GS/si)의 농도(b )
다음으로, 우리는 RNAi에 대한 나노겔의 농도 효과를 조사했습니다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 유전자 간섭 효율은 80 μg/ml의 복합 농도에서 최대에 도달하였다. 120 μg/ml 농도에서 감소된 KD 효율은 앱타머의 증가된 세포독성 때문일 수 있습니다. 또한 엔도솜 탈출제 리포솜의 추가는 낮은 농도의 Apt-GS/siRNA 나노겔(40 μg/ml 및 80 μg/ml)에서 RNA 간섭 효율을 증가시킬 수 있지만 높은 농도(120 ㎍/ml). 따라서 Apt-GS는 siRNA를 종양 세포에 성공적으로 전달할 수 있으며 결과적으로 특정 RNAi를 생성할 수 있다고 믿어집니다.
siRNA의 안정성과 조직 특이적 전달은 RNAi 치료제의 가장 큰 장애물로 남아 있습니다. 여기서 deoxynucleotide로 치환된 siRNA는 siRNA의 안정성을 향상시키기 위해 사용되었으며, GS core는 siRNA의 산화환원 반응 전달을 위한 종양 표적화를 위한 AS1411 aptamer와 disulfide linker로 더 코팅되었습니다. 차량은 약 200 nm 크기의 구형 구조를 가지며 표면에 양전하를 띠고 있습니다. 이러한 준비된 Apt-GS/siRNA 나노겔은 화물을 보호할 수 있고 이황화물 절단에 의한 DTT 첨가 하에서 가속화된 siRNA 방출을 나타냈다. 더욱이, 표적화 앱타머 AS1411을 통해 새로운 Apt-GS 나노겔 Apt-GS는 세포질에 더 많은 화물을 효과적으로 전달하고 방출할 수 있어 상당한(뉴클레오린 과발현 A549 세포에서 침묵 활성의 시험관 내 개선이 ~ 5배 향상됨) 유의미한 결과를 초래할 수 있습니다. 전반적으로, 이러한 발견은 데옥시뉴클레오티드 치환 siRNA의 전달이 혁신적인 전략이며 이러한 산화환원 반응, 종양 표적화 스마트 나노겔이 siRNA 전달 및 종양 치료에 큰 가능성을 갖고 있음을 시사합니다.
이 기사의 결론을 뒷받침하는 데이터 세트가 기사에 포함되어 있습니다.
3-아미노프로필-트리메톡시실란
Dulbecco의 수정된 Eagle 배지
디메틸설폭사이드
플루오레세인 아미다이트
겔 전기영동
3-글리시독시프로필-트리메톡시실란
실록산-가교 젤라틴 나노겔
3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드
RNA 간섭
작은 간섭 RNA
아니 -숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트
음성 DNA 올리고뉴클레오티드
결론
데이터 및 자료의 가용성
약어
나노물질
초록 현재 다양한 형광 나노물질이 외과용 항법용 광학 조영제로 설계 및 합성되고 있다. 그러나, 실리콘 양자점(Si QD)을 이용한 폐암 수술 항법용 형광 조영제의 제조에 대한 보고는 없었다. 이 연구는 Pi et al.에 의해 보고된 수분산성 Si QD 미셀을 개선하고 수정했습니다. Si QD 미셀-CKAP4를 준비합니다. 데이터는 Si QD 미셀-CKAP4가 약 78.8nm의 평균 수압 직경을 갖는 구형 입자임을 보여주었습니다. Si QD 미셀-CKAP4의 UV-가시광 흡수 범위는 200~500nm입니다. 여기 파장이 330n
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
