고생체적합성 Au 나노케이지@PEG 나노입자: 향상된 생체 내 영상을 위한 새로운 CT 조영제

초록

최근 조영제는 영상 기술의 품질 향상을 위해 널리 사용되고 있습니다. 나노입자는 기존 분자 크기의 조영제보다 생체 내 검출 능력이 뛰어납니다. 본 연구에서는 강한 X선 흡수 계수를 가진 새로운 유형의 Au 나노케이지@PEG 나노입자(AuNC@PEGs)를 합성하여 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔 영상용 조영제로 개발했습니다. 그 결과 AuNC@PEGs는 우수한 수용액 분산성, 낮은 세포독성, 강한 X선 흡수 능력을 보였습니다. 또한 생체 내 연구에서 합성된 AuNC@PEGs는 뚜렷한 조영 증강 효과, 긴 혈중 순환 시간, 무시할 만한 생체 내 독성을 나타냈습니다. 따라서 본 연구에서 합성된 기능화된 AuNC@PEGs는 CT 스캔 영상 분야에서 임상 적용 잠재력이 매우 높습니다.

서론

최근 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔은 임상 현장에서 가장 흔히 사용되는 진단 영상 기술로, 다양한 인체 조직 연구에 폭넓게 활용되고 있습니다. CT 스캔은 강한 투과력, 높은 조영 능력, 비교적 간단한 영상 처리 덕분에 현대 의료 시스템에서 가장 강력한 비침습적 영상 진단 기술로 여겨집니다[1, 2]. 그러나 영상 과정에서 병변과 주변 구조물 사이에 자연적인 조영 차이가 없는 경우가 많습니다. 따라서 표적 구조나 조직, 장기를 구별하기 위해 상대적으로 밀도가 높거나 낮은 물질인 조영제를 사용해야 합니다. 이 물질은 조직마다 흡수 능력이 달라 X선 조사 시 연조직에서 관찰할 수 있습니다. CT 스캔 영상에서 일부 분자와 여러 미세입자 조영제의 사용이 평가되어 왔습니다[3,4,5].

현재 CT 스캔에 가장 흔히 쓰이는 조영제는 요오드를 함유한 유기 분자입니다. 요오드화 이온이나 비이온성 제제 같은 요오드화 분자는 임상에서 CT 스캔 조영제로 널리 쓰입니다. 요오드화 분자가 좋은 CT 조영 증강 효과를 제공하지만, 신장 청소율이 빠르고 체내 순환 시간이 짧으며 알레르기 유발성이 있어 추가 적용이 크게 제한됩니다[6, 7]. 요오드 현상제의 빠른 제거로 혈액 풀 영상의 유효 시간 창이 심각하게 제한되어 고대비 영상을 얻기 어렵습니다. 또한 고용량 약물의 빠른 청소는 신장에 잠재적 부작용을 초래할 수 있습니다[8, 9].

지난 10년간 나노입자의 생물의학 응용, 특히 진단 영상 분야가 큰 주목을 받았습니다[10]. 요오드 기반 조영제와 비교해 나노입자는 작은 분자가 갖지 못한 조영 특성을 탑재할 수 있으며, 특정 크기, 모양, 표면을 가집니다[11, 12]. 일반적으로 금, 은 등 원자 번호가 큰 금속 나노입자는 우수한 X선 흡수 계수를 가져 탁월한 조영 증강 능력을 보입니다[13, 14]. 이 중 금 나노입자는 생물학적 관성이 크고 합성 및 표면 수정이 용이해 요오드 기반 영상제의 대체재로 급속히 발전해 왔습니다[15,16,17]. 금 나노입자는 요오드 화합물보다 혈중 순환 시간이 길고, 신장 독성 위험이 낮으며, X선 흡수 계수가 강해 더 적은 용량으로 부작용 위험을 줄일 수 있습니다[18]. 나노구, 나노로드, 나노스타 등 여러 금 나노입자가 CT 스캔 조영제로 널리 쓰이며 유망한 효과를 보입니다[19, 20]. 다양한 금 나노구조 중 Au 나노케이지는 속이 비어 있고 얇은 다공성 벽을 가져 다른 형태의 금 나노입자보다 표면적이 넓고 CT 스캔 영상 능력이 더 효과적입니다[21, 22]. 최근 Au 나노케이지는 광간섭단층촬영과 광음향단층촬영의 조영 증강제로 사용되어 좋은 성능을 보였습니다. 또한 넓은 흡수 면적 덕분에 효과적인 광열 변환체로도 작용합니다[23, 24]. 우리가 아는 한, Au 나노케이지를 CT 스캔 조영제로 평가한 연구는 극소수입니다. 위 연구들을 바탕으로 본 연구에서는 Au 나노케이지를 CT 스캔 조영제로 활용하는 방안을 추가로 탐구했습니다. CT 영상에서 나노입자 적용에는 생체적합성과 생물학적 활성을 가진 표면이 필요합니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 생분해성, 생체적합성 고분자로, 망상내피계(RES) 포획을 방지하고 생체적합성, 신장 청소 능력, 혈중 순환 시간을 개선하는 스텔스 소재로 쓰입니다. 따라서 PEG화된 나노입자는 오랫동안 혈액에 머무를 수 있습니다[15, 25,26,27,28].

본 연구에서는 새로운 AuNC@PEGs를 제조하고 특성을 분석했습니다. 이어서 MTT 비교색법, 젖산 탈수소효소(LDH) 누출법, 세포 내 활성산소종(ROS) 농도 측정, Calcein-AM/PI 염색 등 다양한 실험 기법으로 AuNC@PEGs의 생체 외 생체적합성을 평가했습니다. 또한 혈액학적, 조직학적 분석을 통해 AuNC@PEGs의 생체 내 독성을 확인했습니다. 그 결과 AuNC@PEGs는 생체 내외에서 우수한 생체적합성을 보였습니다. 게다가 AuNC@PEGs는 생체 내외에서 더 강한 CT 스캔 영상 능력을 나타냈습니다. 이러한 실험 결과는 합성된 AuNC@PEGs가 강한 조영, 긴 혈중 순환 시간, 낮은 신장 독성 위험 등 뚜렷한 장점을 가짐을 보여줍니다. 따라서 본 연구에서 합성된 기능화된 AuNC@PEGs는 CT 스캔 영상에서 임상 적용 잠재력이 매우 높습니다.

재료 및 방법

모든 실험 프로토콜은 중국 랴오닝성 진저우 의과대학 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

재료 및 기기

LDH 및 ROS 시험 키트는 중국 난징 생물공학연구소에서, Calcein-AM/PI 염색 키트는 중국 상하이 동런 화학기술 유한회사에서 구입했습니다. 기타 화학 시약과 용매는 Sigma-Aldrich에서 구매했습니다. 모든 절편은 형광 현미경(DMI4000B, Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰했습니다. 합성된 나노입자의 특성은 투과전자현미경(TEM)으로 평가했습니다. 256열 512슬라이스 나선형 CT 스캐너(Philips, Germany)를 사용했으며, 영상 파라미터는 다음과 같습니다: 슬라이스 두께 0.625 mm, 관 전압 100 kVp, 관 전류 100 mA.

AuNC@PEGs 합성

Au 나노케이지는 선행 연구[29, 30]에 따라 Ag 나노큐브와 HAuCl₄ 용액 사이의 간단한 갈바닉 치환 반응으로 제조했습니다. 일반적으로 25 nm Ag 나노큐브를 디에틸렌 글리콜에서 제조해 30 nm Au 나노케이지 합성의 주형으로 사용했습니다. 이후 SH-PEG(분자량 ≈ 2000, 10 mg을 인산완충생리식염수(PBS) 5 mL에 용해)를 AuNC 용액(pH 8.0, 6.55 nM, 6 mL)에 넣고 질소 분위기에서 암실 조건으로 하룻밤 교반했습니다. AuNC@PEGs를 세 번 더 세척한 후 수용액에 분산시켰습니다.

생체 외 독성 평가

본 연구에서는 MTT 비교색법, LDH 누출법, 세포 내 ROS 농도 측정, Calcein-AM/PI 염색을 이용해 합성된 AuNC@PEGs의 생체 외 독성을 검출했습니다. HUVEC 세포를 96웰 플레이트에 1 × 10⁴/well 밀도로 접종했습니다. 10% 태아소혈청, 페니실린(100 μg/mL), 스트렙토마이신을 보충한 RPMI-1640 배지를 사용했습니다. 세포를 37°C, 5% 이산화탄소 배양기에서 12시간 배양했습니다. 이후 AuNC@PEGs를 다양한 농도(10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL)로 첨가해 추가 배양했습니다. 24시간 후 MTT 분석을 수행했습니다. 나노입자가 없는 배양액을 각 그룹의 대조군으로 사용했습니다.

이어서 AuNC@PEGs 다양한 농도(10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL)로 처리한 HUVEC 세포에서 방출된 젖산 탈수소효소(LDH) 함량을 측정해 생체 외 독성을 평가했습니다. 세포 접종은 MTT와 동일하게 진행했으며, 24시간 후 상층액을 분리, 원심분리해 깨끗한 96웰 플레이트로 옮겼습니다. 제조사 지침에 따라 배양액 내 LDH 활성을 측정하고 효소표지 기기(450 nm)로 흡광도를 측정했습니다.

ROS 키트를 이용한 세포 내 ROS 농도 측정 원리에 따라, 2',7'-디클로로플루오레세인(DCFH-DA) 존재 하에서 DCFH가 산화되어 강한 녹색 형광 물질인 디클로로플루오레세인(DCF)이 됩니다. HUVEC 세포를 24웰 플레이트에서 12시간 배양한 후 AuNC@PEGs 다양한 농도(50, 100, 200, 500 μg/mL)로 24시간 처리하고, 37°C에서 40분간 DCFH-DA와 배양했습니다. 과산화수소(H₂O₂)로 처리한 세포를 양성 대조군으로 사용했습니다. 형광 현미경(λex 485 nm, λem 525 nm)으로 세포의 형광 강도를 관찰했습니다. 평가 전 혈청 및 얼음 없는 배지로 세 번 세척했습니다.

살아있는/죽은 세포 염색을 위해 HUVEC 세포를 24웰 플레이트에 접종해 12시간 배양했습니다. 이후 AuNC@PEGs 다양한 농도(10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL)로 24시간 처리했습니다. 트립신-EDTA로 소화 후 원심분리하고, PBS(pH 7.4)로 세척했습니다. 준비된 세포 현탁액을 미리 배합한 Calcein-AM/PI 시약과 혼합해 37°C에서 15분간 배양했습니다. 형광 현미경으로 죽은 세포 수를 측정해 AuNC@PEGs의 독성을 검출했습니다.

동물 모델

모든 동물 실험 절차는 진저우 의과대학 동물보호및이용위원회의 기준에 따라 수행했습니다. 실험 후 인도적 원칙에 따라 동물을 안락사시켰습니다. 본 연구에서는 몸무게 250–300 g의 성체 Sprague Dawley 쥐(진저우 의과대학 실험동물센터 구매)를 사용했습니다. 모든 동물을 무작위로 그룹으로 나눴습니다. 클로랄 하이드레이트 용액(10 wt%)을 복강 투여한 후 모든 물질을 꼬리 정맥으로 주입했습니다.

생체 내외 CT 스캔 영상

생체 외 CT 스캔 영상을 위해 다양한 농도의 AuNC@PEGs와 요오드 용액을 EP 튜브에 넣고 적절히 배열한 후 전후방향으로 CT 스캔을 수행했습니다. 생체 내 CT 스캔에서는 마취 후 복강 중심을 기준으로 두부에서 미부 방향으로 스캔했으며, 매번 동물 위치를 동일하게 유지했습니다. 모든 원본 데이터(0.625 mm 영상)를 Philips 워크스테이션으로 전송해 CT 스캔으로 분석했습니다.

생체 내 독성 평가

혈액학적 분석은 표준 복재정맥 채혈법으로 수행했습니다. 쥐의 심장, 간, 비장, 폐, 신장 조직을 4% 파라포름알데히드로 48시간 고정한 후 탈수해 파라핀에 포매했습니다. 파라핀 절편 두께는 5 μm로 슬라이드 글라스에 마운트했습니다. 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 후 현미경으로 분석했습니다.

통계 분석

데이터는 일원분산분석으로 분석했으며, P 값을 지표로 사용했습니다. P 값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주했으며, 평균 ± 표준편차로 표현했습니다.

결과 및 고찰

AuNC@PEGs의 합성 및 특성 분석

표면 기능화와 크기 조절은 고성능 나노 조영제 개발의 두 가지 핵심 요소입니다[15]. AuNC@PEGs의 구조와 특성은 TEM과 DLS로 확인했습니다. 그림 1a에서 AuNC@PEGs의 크기는 약 40 nm로 높은 균일성을 보였습니다. 그림 1b의 수화 반지름은 약 50 nm로 AuNC@PEGs가 응집 없이 매우 안정적으로 분산됨을 보여줍니다. AuNC@PEGs는 크기가 작고 생물학적 관성이 상대적으로 좋아 나노의학 적용에 적합합니다. 또한 중공 케이지 구조는 내부 및 외부 비표면적이 넓어 CT 스캔 영상 능력이 뛰어나며, 주변 금속 벽이 가공, 수송, 보관 중 탑재 물질에 추가 보호막을 제공합니다. 뚜렷한 코어-셸 구조로 외부가 생체적용 가능한 PEG로 덮여 있어 생체적합성을 효과적으로 높이고 대식세포 포획을 회피할 수 있습니다.

TEM images of AuNC@PEGs (a) and DLS of AuNC@PEGs (b)

AuNC@PEGs의 생체 외 안전성 및 안정성

AuNC@PEGs를 생체 내 영상에 사용하기 전 안전성과 안정성을 평가했습니다. MTT 분석으로 AuNC@PEGs가 HUVEC 세포 생존율에 미치는 영향을 측정했습니다(그림 2a). 세포를 AuNC@PEGs 다양한 농도(10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL)로 24시간 처리했습니다. MTT 분석 결과 AuNC@PEGs 처리군의 세포 생존율은 대조군과 유사했으며, AuNC@PEGs 농도 200 μg/mL까지 우수한 생체적합성을 보였습니다. 1000 μg/mL 농도에서도 생존율이 75% 이상이었습니다.

MTT evaluation of the viability of HUVEC cells cultured with different AuNC@PEGs concentrations for 24 h (a). Assessment of lactate dehydrogenase in supernatant induced by AuNC@PEGs with LDH (b). Examination of 24 h fluorescence imaging of cells cultured with AuNC@PEGs at different concentrations (H₂O₂ (I), 0 μg/mL (II), 50 μg/mL (III), 100 μg/mL (IV), 200 μg/mL (V) and 500 μg/mL (VI)) by ROS method (c). *P < 0.05, ***P < 0.001. Scale bars are 100 μm

LDH 분석으로도 AuNC@PEGs의 생체적합성을 평가했습니다. 정상 세포에서는 LDH가 세포막을 통과하지 못하지만, 세포막 손상 시 LDH가 세포막을 통해 방출됩니다[31]. 따라서 다양한 농도의 AuNC@PEGs로 24시간 처리한 세포의 상층액 내 LDH 함량을 측정해 안전성을 평가했습니다(그림 2b). 그 결과 AuNC@PEGs 농도 200 μg/mL 미만에서는 대조군 대비 LDH 방출량이 약간 증가했으며, 양성 대조군(H₂O₂)보다 유의하게 낮아 MTT 결과와 일치했습니다. 200 μg/mL AuNC@PEGs가 좋은 세포 적합성을 보이는 최적 농도임을 확인했습니다.

또한 산화 스트레스 시험과 생존/사멸 세포 면역형광 염색(Calcein-AM/PI)을 수행해 AuNC@PEGs의 생체 외 독성을 검출했습니다. 산화 스트레스는 모든 생명 시스템에 해로운 상태이며, 과도한 ROS는 산화 스트레스를 유발합니다[32, 33]. 따라서 세포 내 ROS 수준을 측정했습니다. 다양한 농도의 AuNC@PEGs로 24시간 유도한 후, 50–200 μg/mL 농도에서 세포의 녹색 형광 강도가 대조군과 유의한 차이가 없었고 양성 대조군보다 현저히 낮았습니다(그림 2c). 형광 강도는 ROS 수준에 비례합니다. 그림 3에서 보듯 0–200 μg/mL 농도에서 HUVEC 세포 생존율이 90% 이상이었습니다(그림 3a–f). 위 결과는 200 μg/mL AuNC@PEGs가 안정적이고 세포 적합성이 좋아 유망한 임상 조영제가 될 수 있음을 입증합니다.

Fluorescence microscopy images of live and dead staining. Survival rate of HUVEC cells treated with AuNC@PEGs at different concentrations (0 μg/mL (a), 10 μg/mL (b), 20 μg/mL (c), 50 μg/mL (d), 100 μg/mL (e), 200 μg/mL (f), 500 μg/mL (g), and 1000 μg/mL (h)) for 24 h. Green fluorescence represents living cells and red fluorescence represents dead cells. The scale bars are 100 μm

생체 외 CT 스캔 영상 및 CT 값 측정

AuNC@PEGs의 CT 스캔 영상 적용 가능성을 평가하기 위해 다양한 몰농도(AuNC@PEGs)의 조영 증강 효과를 임상용 조영제(요오드)와 비교했습니다. CT 스캔 영상을 획득하고 CT 값을 측정했습니다. AuNC@PEGs를 요오드 조영제와 유사 농도(50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL)에서 비교했습니다. 그 결과 농도 증가에 따라 CT 값이 증가했습니다(그림 4a). AuNC@PEGs와 요오드 조영제의 CT 값 분석(그림 4b)에 따르면, 유사 농도에서 AuNC@PEGs의 흡수 계수가 요오드 기반 조영제보다 우수해 CT 스캔 영상에 AuNC@PEGs를 사용하는 것이 더 효과적임을 나타냅니다.

Comparison of computed tomography scan findings in vitro between AuNC@PEGs and iodine-based contrast agent. As the concentration increases, the intensity of X-ray attenuation increases (a). Comparison of Hu values between AuNC@PEGs and iodine-based contrast agents (b). ***P < 0.001

생체 내 CT 스캔 영상

AuNC@PEGs의 높은 조영 능력을 바탕으로 생체 내에서 AuNC@PEGs와 요오드 조영제의 영상 품질을 추가 비교했습니다. 쥐 꼬리 정맥으로 AuNC@PEGs(200 μg/mL) 200 μL를 주입했습니다. 주입 전(0분)과 주입 후 연속 시간점(10, 20, 30, 40, 60, 90분)에서 스캔해 AuNC@PEGs의 혈액 풀 혈관조영 시간을 평가했습니다. 대조군 쥐에는 적정 농도의 요오드 조영제를 주입했으며, 주입 용량과 스캔 시간은 AuNC@PEGs와 동일하게 했습니다. 조영제 주입 후 신장(그림 5)과 방광 충만(SI 그림 1)의 조영 증강을 동시에 관찰했습니다. 그 결과 AuNC@PEGs 그룹의 신장은 30분에 피크에 도달해 90분에 완전히 배설된 반면, 요오드 조영제 그룹은 20분에 피크, 60분에 완전 배설되었습니다. 방광이 시간이 지남에 따라 조영제로 점차 충만되는 것을 관찰했습니다. 이는 AuNC@PEGs의 혈액 풀 혈관조영 시간이 요오드 조영제보다 긺을 보여줍니다. AuNC@PEGs의 더 긴 혈중 순환 시간은 더 나은 진단을 가능하게 하며, AuNC@PEG는 더 나은 개발 전망을 가집니다.

In vivo CT images of the rats at different time points after post-injection of AuNC@PEGs

AuNC@PEGs의 생체 내 안전성

그림 6a에서 보듯, 일상적인 혈액 및 간·신장 기능 검사의 표준 파라미터는 헤모글로빈 수치, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, 평균 적혈구 용적, 혈소판 수, 적혈구 수, 백혈구 수, 알부민 농도, 알라닌 아미노전이효소 수치, 아스파르트산 아미노전이효소 수치, 크레아티닌 수치로 반영되었습니다. 통계 분석 결과 AuNC@PEG 그룹, 요오드 조영제 그룹, 대조군 사이에 유의한 차이가 없었습니다(P > 0.05). 또한 쥐의 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장)를 조직학적으로 분석했습니다(그림 6b). AuNC@PEGs(200 μg/mL) 주입 24시간 후 장기를 절제, H&E 염색한 결과, 대조군(나노물질 미주입)과 비교해 현미경 하에서 뚜렷한 형태학적 변화나 손상이 관찰되지 않았습니다. 위 결과는 AuNC@PEGs의 생체 내 안전성과 신뢰성을 추가로 확인시켜줍니다.

In vivo toxicity evaluation of AuNC@PEGs. Blood routine and liver and kidney function: hemoglobin level (I), mean corpuscular hemoglobin concentration (II), mean corpuscular volume (III), platelet (IV), red blood cell count (V), white blood cell count (VI), albumin concentration (VII), alanine aminotransferase level (VIII), aspartate aminotransferase level (IX), and creatinine level (X) (a). H&E staining was performed in the organs (the heart, liver, spleen, lung, and kidney) of normal rats and those injected with AuNC@PEGs for 24 h (b). The scale bars of b are 100 μm

결론

우리는 작은 크기, 높은 조영, 긴 혈액 잔류 시간, 낮은 독성 위험 등의 특성을 가진 새로운 유형의 CT 스캔 조영제 AuNC@PEG를 개발했습니다. 생체 내외 독성 평가에서 AuNC@PEGs는 우수한 생체적합성과 낮은 부작용 위험을 보였습니다. 생체 내외 CT 스캔 영상 성능에서 AuNC@PEGs는 기존 요오드 기반 조영제보다 높은 X선 흡수 계수와 더 긴 혈액 풀 혈관조영 시간을 나타냈습니다. 또한 AuNC@PEGs는 요오드 기반 조영제보다 우수하며 실용적입니다. 이 모든 결과는 AuNC@PEGs가 기존 요오드 기반 조영제보다 높은 X선 흡수 계수를 가지며, 영상 성능도 더 뛰어남을 보여줍니다. 따라서 본 연구에서 합성된 기능화된 AuNC@PEGs는 CT 스캔 영상에서 임상 적용 잠재력이 매우 높습니다.