무기산 도핑을 통한 표면 형상 제어로 폴리아닐린/폴리락트산 나노섬유 스캐폴드의 생체적합성 향상

초록

전도성 및 생분해성 나노섬유 스캐폴드는 외부 전기장 하에서 세포 성장, 증식, 분화를 촉진하는 데 큰 잠재력을 가집니다. 체액 내 열악한 전기 전도성 문제가 여전히 존재하지만, 폴리아닐린(PANI) 기반 생분해성 나노섬유는 세포 부착, 성장, 증식을 촉진할 수 있습니다. 이 효과가 PANI 형상에 기인하는지 조사하기 위해, PANI의 현장 산화 중합 과정에서 염산, 황산, 과염소산 세 가지 무기산을 도펀트로 선택했습니다. 얻어진 폴리아닐린/폴리락트산(PANI/PLA) 복합 나노섬유를 SEM, FTIR, XPS 분석으로 특성화한 결과, PLA 나노섬유가 다공성 구조 변화 없이 PANI로 성공적으로 코팅됨을 확인했습니다. 체외 기계적 특성과 생분해성 실험 결과, 산 도펀트의 산화력을 고려해야 하며, 이것이 PLA 나노섬유에 더 높은 산화 분해 효과를 줄 가능성이 있음을 시사했습니다. 접촉각 테스트 결과, 다양한 표면 형상을 가진 PANI/PLA 복합 나노섬유가 좋은 습윤성을 보여 골조직 공학 스캐폴드 요구사항을 충족함을 입증했습니다. 표면 거칠기와 세포 생존율 결과, PANI의 표면 형상이 다를수록 세포 증식을 촉진하며, PANI 표면 거칠기가 높을수록 생체적합성이 우수함을 보였습니다. 결과적으로, 다양한 산 도핑을 통한 PANI/PLA 복합 나노섬유의 조절된 표면 형상은 조직 공학에서 생체적합성에 긍정적 영향을 미칩니다.

서론

세포외 기질(ECM)은 세포가 세포외 기질로 분비하는 거대분자 네트워크 유형입니다. 세포, 조직, 장기의 기반을 제공하며 복잡한 격자 구조를 특징으로 합니다[1, 2]. 또한 세포 생존과 활동에 적합한 부위를 제공하고, 세포 형태 결정, 분화 조절, 이동과 대사 참여, 궁극적으로 생존, 성장, 사멸에 영향을 미칩니다[3, 4]. 전기방사 나노섬유는 높은 비표면적, 적절한 기계적 특성, 생분해성으로 세포외 기질의 작용을 모사해 세포 행동을 조절할 수 있습니다. 또한 다공성 구조를 유지하면서 표면 개질을 통해 다기능화할 수 있습니다. 따라서 전기방사 나노섬유는 조직 공학에서 유망한 후보 소재로, 약물 전달, 골 재생, 신경 재생 및 복구 등에 널리 적용됩니다[5-10].

전도성 고분자(폴리피롤[PPy], 폴리티오펜[PTH], 폴리아닐린[PANI] 등)는 우수한 체내외 생체적합성을 가지며, 세포 부착, 증식, 분화 및 조직 재생에 유의미한 영향을 미칩니다[11-13]. 이 중 PANI은 우수한 공정성, 탁월한 전도성, 좋은 산화환원 안정성, 생체적합성으로 조직 공학과 재생 의학의 잠재적 소재로 여겨집니다[14, 15]. 전기 자극 하에서 PANI은 세포 부착, 증식, 이동, 분화를 조절할 수 있습니다[16, 17]. 실제로 수많은 보고가 PANI 기반 전도성 생분해 복합 나노섬유가 전기장 하에서 세포 행동을 촉진함을 결론지었습니다[18-21]. 그러나 생리 환경(pH 7.4)에서 PANI의 전도성이 탈도핑으로 약해져, 세포 증식과 분화 촉진이라는 전기적 활성 이점이 감소하는 중요한 문제가 있습니다[22]. 이는 외부 전기 자극 하 골조직 공학에서 PANI 기반 전도성 생분해 나노섬유의 한계를 명확히 보여주지만, 여전히 세포 증식과 성장을 유의미하게 촉진할 수 있습니다[23, 24]. 여기서는 PANI 표면 형상이 복합 나노섬유의 거칠기를 증가시켜 세포 부착, 성장, 증식에 유리하다고 추측했습니다.

무기산으로 도핑된 폴리아닐린은 일반적으로 우수한 전기 전도성을 가집니다. 그러나 다양한 무기산 도펀트가 도입하는 음이온은 폴리아닐린의 전도성과 구조에 영향을 미칩니다[25-27]. 본 논문에서는 세 가지 일반적인 무기산, 즉 염산(HCl, HA), 황산(H₂SO₄, SA), 과염소산(HClO₄, PA)을 PANI 현장 산화 중합의 도펀트로 선택했습니다. 이후 서로 다른 산 도펀트 하에서 PANI/폴리락트산(PLA) 나노섬유의 기계적 특성, 습윤성, 표면 형상, 생체적합성, 세포 부착을 조사했습니다. 결과는 PANI 표면 거칠기가 높을수록 세포 증식이 좋아져 더 우수한 생체적합성을 보임을 나타냈습니다.

실험 방법

시약

아닐린(AN)은 Sigma에서, PLA(Mw = 60,000)는 Solarbio에서, 디클로로메탄(DCM)은 천진 푸위 파인 케미칼사에서, N,N-디메틸포름아미드(DMF)는 Macklin에서 구입했습니다. 한편 과황산암모늄(APS)은 Aladdin에서, HCl과 H₂SO₄는 광저우 케미칼사에서, HClO₄는 Macklin에서 구입했습니다.

폴리아닐린/폴리락트산 나노섬유 제조

전기방사 폴리락트산 나노섬유 제조

특정 질량의 PLA 입자를 DCM과 DMF 혼합 용액(부피비 7:3)에 넣고 녹을 때까지 교반해 10% PLA 혼합 용액을 얻었습니다. PLA 용액을 주사기에 담아 고전압 전원과 연결했습니다. 전기방사 장치(DP-30, 천진 운판 테크놀로지사)를 전압 15 kV, 거리 15 cm로 설정했습니다. 얻어진 PLA 나노섬유를 40°C에서 하룻밤 진공 건조했습니다.

서로 다른 무기산으로 도핑된 폴리아닐린/폴리락트산 나노섬유 제조

PLA 나노섬유를 플라즈마 세정기 챔버(PCE-6, MTI Corporation, USA)에 넣고 30 W RF 파워로 2분 방전했습니다. 본 논문에서는 HCl, H₂SO₄, HClO₄ 세 가지 일반 무기산을 PANI 현장 산화 중합의 도펀트로 사용했습니다[24]. 해당 PANI 나노섬유를 각각 PANI-HA, PANI-SA, PANI-PA로 표시했고, PANI/PLA 나노복합 나노섬유는 PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA로 표시했습니다. PLA와 PANI/PLA 복합 나노섬유 제조 공정 개략도는 그림 1에 나타냈습니다.

PLA와 PANI/PLA 복합 나노섬유 제조 공정 개략도

PANI/PLA 나노복합 나노섬유는 아이스배스 조건에서 제조했습니다[16, 28]. APS와 AN을 1:1 몰비로 1 M 산 용액에 첨가했습니다. 여기서는 HCl을 예로 들어 PANI/PLA 나노섬유 제조 과정을 설명합니다. 아이스배스 조건에서 AN(930 mg, 0.01 mol)을 APS(2,280 mg, 0.01 mol)가 녹아 있는 50 mL의 1 M HCl에 적가했습니다. 즉시 플라즈마 처리된 PLA 나노섬유 막을 용액에 담그고 0°C에서 2시간 교반했습니다. 반응 후 PLA 나노섬유 막을 HCl과 에탄올로 여러 번 세척해 부착되지 않은 PANI를 제거하고 40°C에서 하룻밤 건조해 PANI/PLA-HA 나노섬유를 얻었습니다. PANI/PLA-SA와 PANI/PLA-PA 복합 나노섬유도 유사한 방법으로 얻었습니다.

특성 분석

PLA 나노섬유와 PANI/PLA 복합 나노섬유의 단축 인장 시험은 변형-응력 시험기(Shimadzu AGX-PLUS, 일본)로 수행했습니다. 시편을 덤벨 형태로 절단하고 인장 속도를 3 mm/min으로 일정하게 유지했습니다. 영률은 응력-변형 곡선의 0-15% 변형 선형 영역에서 계산했으며, 인장 강도와 파단 신장률은 나노섬유 막 파단 지점에서 결정했습니다.

나노섬유 스캐폴드 형상은 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, Hitachi-SU8220, 일본)으로 관찰해 서로 다른 무기산으로 도핑된 PANI의 다양한 형상을 확인했습니다. SEM 관찰 전 나노섬유 시료를 60초간 금 코팅해 형상을 더 선명히 관찰했습니다. 한편 PANI/PLA 복합 나노섬유의 표면 거칠기는 원자 힘 현미경(AFM, Bruker Dimension Edge)으로 측정했습니다. PANI이 PLA 나노섬유에 완전히 적재되었는지 확인하기 위해 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR, Thermo Nicolet iS50)으로 2000 ~ 500 cm⁻¹ 파장 변화를 측정했습니다. X선 광전자 분광법(XPS, Thermo ESCALAB 250)과 Al-Kα X선원을 사용해 PANI/PLA 나노섬유의 표면 조성을 추가로 확인했습니다. 습윤성은 상온에서 물방울의 접촉각 분석(OCA 15 plus, 독일)으로 측정했습니다. 나노섬유의 분해는 질량 손실법[29, 30]으로 평가했습니다. 나노섬유 막을 16 mm 디스크로 잘라 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 20 mL에 넣고 37°C에서 7, 14, 21일간 배양한 후 일정 무게가 될 때까지 건조했습니다.

PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드의 생체적합성

생체적합성

본 논문에서는 인간 골육종(HOS) 세포 활성 실험으로 PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드의 생체적합성을 평가했습니다. HOS 세포는 중국과학원 상하이 세포은행에서 구입했습니다. HOS 세포를 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신을 함유한 저당 둘베코 변성 이글 배지(DMEM)에서 배양하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양했습니다. 세포 융합도가 90%에 도달하면 1:3 비율로 계대 배양했습니다.

세포 증식 시험 전 HOS 세포를 PANI/PLA 나노섬유에 접종했습니다. 나노섬유를 96웰 플레이트 바닥에 완전히 덮이게 놓고 30분간 UV 살균, 75% 에탄올 용액으로 30분간 살균 후 PBS로 세척했습니다. 이후 1 × 10⁴ cells/well 밀도로 접종했고, 동시에 블랭크 그룹과 대조 그룹을 설정했습니다. 세포를 37°C 세포 배양기에서 1, 3, 5일간 배양하며 이틀마다 배지를 교체했습니다.

PANI/PLA 나노섬유의 세포 생존율은 MTT 분석법으로 평가했습니다. 1, 3, 5일 배양 후 96웰 플레이트에서 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 5 mg/mL MTT를 10% 함유한 1 mL DMEM을 첨가했습니다. 37°C에서 4시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO를 첨가해 포르마잔을 용해시켰습니다. 10분간 진동 후 흡광도를 측정했습니다(BioTek Synergy HTX, USA).

형광 면역 염색

HOS 세포를 PANI/PLA 나노섬유 배양기에서 24시간 배양하고 PBS로 3회 세척했습니다. 4% 파라포름알데히드로 10분간 실온에서 고정했습니다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척(각 10분)하고 100 nM FITC 표지 펩타이드 10 μL을 첨가해 실온에서 30분간 배양한 후 PBS로 3회 세척(각 5분)했습니다. HOS 세포의 세포외 액틴을 염색하고 공초점 현미경(Type A1, Nikon, 일본)으로 20배 배율에서 관찰했습니다.

세포 부착

PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드 상의 HOS 세포 부착을 SEM으로 관찰했습니다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 4% PFA를 첨가했습니다. 4°C에서 하룻밤 고정하고 PBS로 3회 세척한 후 에탄올 농도 구배 용액(30%, 50%, 70%, 85%, 90%, 100%; 각 20분)으로 탈수하고 24시간 동결 건조했습니다. SEM 관찰 전 나노섬유를 120초간 백금 코팅해 더 선명히 관찰했습니다.

알칼리 포스파타제 활성(ALP)

ALP는 알칼리 포스파타제 효소 발현에 의존하는 일반적인 초기 골아세포 분화 표지자 중 하나입니다. 본 연구에서는 ALP Assay Kit(Beyotime Biotechnology, P0321S)를 사용했습니다. HOS 세포를 서로 다른 PANI/PLA 복합 스캐폴드에서 지정된 7일간 배양했습니다. 세포를 0.1 M Tris-HCl(pH 8)에 0.1% (v/v) 트리톤 X-100 50 μL로 용해했습니다. ALP 활성은 p-니트로페닐 인산(PNPP)에서 생성된 p-니트로페놀 농도를 405 nm 흡광도로 정량해 분석했습니다. PANI/PLA 나노섬유에서 배양된 세포의 ALP 활성 백분율은 순수 PLA 나노섬유에서 배양된 세포의 ALP 활성과 비교해 계산했습니다.

통계 분석

결과의 통계적 유의성은 GraphPad Prism(버전 8.02)을 사용한 일원 분산 분석(ANOVA)으로 평가했습니다. 서로 다른 PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드 간의 기계적 특성, 체외 생분해성, 세포 생존율 차이를 분석했습니다. p < 0.05일 때 유의함(∗), p < 0.005일 때 매우 유의함(∗∗)으로 판단했습니다.

결과 및 논의

조직 공학 스캐폴드의 기계적 특성은 유체 역학을 견딜 수 있는지 평가하는 중요한 지표입니다. 무기산의 존재는 PANI의 현장 화학적 산화 중합 과정에서 PANI/PLA 복합 나노섬유의 PLA 기질 물성화학적 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 무기산으로 도핑된 PANI/PLA 복합 나노섬유의 기계적 특성 탐구가 필요합니다. 여기서는 인장 시험으로 PANI/PLA 복합 나노섬유의 기계적 특성을 평가했으며, 그림 2에 응력-변형, 영률, 인장 강도, 파단 신장률이 나타나 있습니다. 그림 2a에서 PLA 나노섬유는 선형 탄성 거동을 보였고, PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-SA 복합 나노섬유는 명확한 항복 거동을 보였으며, PANI/PLA-PA 복합 나노섬유는 탄성 변형 후 즉시 파단했습니다. PANI/PLA 복합 나노섬유의 영률(그림 2b)은 PLA 나노섬유보다 높았습니다. PLA 대비 PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA의 탄성률 증가분은 각각 53.5 ± 9.09, 60.00 ± 9.47, 28.43 ± 8.34 MPa였습니다. 인장 강도(그림 2c)와 파단 신장률(그림 2d)에서 PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-PA는 감소한 반면 PANI/PLA-SA는 약간 증가했습니다. PANI/PLA-PA의 인장 강도와 파단 신장률이 가장 낮았습니다. PLA 나노섬유 대비 PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-PA의 인장 강도는 각각 0.15 ± 0.01, 0.64 ± 0.03 MPa 감소했고, PANI/PLA-SA는 0.13 ± 0.05 MPa 약간 증가했습니다. 파단 신장률은 PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-PA에서 각각 16.93 ± 1.38%, 35.42 ± 3.94% 감소했고, PANI/PLA-SA는 3.32 ± 0.13% 증가했습니다.

PLA 나노섬유와 PANI/PLA 복합 나노섬유의 기계적 특성. a 대표 인장 응력-변형 곡선, b 영률, c 파단 인장 강도, d 파단 신장률

그림 2에서 보듯 선택된 무기산은 PANI 코팅 결합을 통해 PLA 나노섬유의 탄성률을 증가시킬 수 있습니다. 인장 강도와 파단 신장률 측면에서, PLA 나노섬유 대비 PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-SA의 기계적 특성은 정도 차이는 있지만 변화했으며, PANI/PLA-PA는 가장 명확히 감소해 시험 중 응력 가하자마자 5초 이내에 파단했습니다. 이는 HClO₄의 산화로 인해 PLA 분자 사슬의 에스테르 결합이 절단되고 카르복실기의 산화 분해가 일어나 기계적 특성이 열화되었기 때문일 수 있습니다[31]. 한편 PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-SA의 서로 다른 기계적 특성은 HCl과 H₂SO₄로 도핑된 PANI의 밀도 차이와 관련될 수 있으며, 반응 공정에서 도입된 APS도 PLA 나노섬유에 약간의 영향을 미쳤을 수 있습니다. 이러한 요인들의 종합적 효과가 서로 다른 기계적 특성을 나타냈습니다[32].

세포 부착, 증식, 분화는 형상에 영향을 받으며, 일반적으로 거친 표면이 세포 부착에 유리하다고 알려져 있습니다[33]. PLA 나노섬유의 소수성은 균일한 PANI 중합을 방해하지만, 플라즈마 표면 처리로 습윤성을 크게 개선할 수 있습니다[34]. 서로 다른 무기산 도펀트로 PANI 기반 현장 중합 후 균일한 표면 증착을 가진 PANI/PLA 복합 나노섬유를 얻었습니다.

서로 다른 PANI/PLA 섬유 표면의 PANI 형상을 FE-SEM으로 관찰했습니다(그림 3). 그림에서 PLA 나노섬유 표면이 많은 불규칙한 나노입자로 덮여 있음을 명확히 볼 수 있으며, 무기산으로 도핑된 PANI/PLA 복합 나노섬유가 좋은 섬유 형상과 다공성 나노섬유 구조를 유지함을 알 수 있습니다. 형상 관찰 결과 PANI/PLA 복합 나노섬유가 PANI로 성공적으로 적재되었으며, 이는 세포 부착과 증식의 기반이 됩니다. 한편 AFM으로 PANI/PLA 복합 나노섬유의 표면 거칠기를 측정했습니다(그림 4). 각 시료의 세 가지 다른 위치에서 측정한 표면 거칠기 평균값 Ra를 일반적으로 표면 거칠기 평가에 사용합니다. 또한 PANI/PLA 복합 나노섬유의 Ra가 PLA 나노섬유보다 컸으며, PANI/PLA-PA의 Ra가 가장 높았습니다. 표면 거칠기 증가는 표면적과 극성을 증가시켜 세포 성장을 위한 더 많은 부위를 제공하고 세포 부착을 촉진할 수 있습니다.

a PLA 나노섬유, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA 복합 나노섬유의 형상

a PLA 나노섬유, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA 복합 나노섬유의 AFM 이미지와 표면 거칠기(Ra)

세포 부착, 이동, 증식은 스캐폴드의 습윤성에 크게 영향을 받습니다[35, 36]. 일반적으로 습윤성은 스캐폴드와 물 사이의 접촉각으로 평가합니다. PLA가 소수성이므로 나노섬유 막 위 물방울의 접촉각을 1초 이내에 측정했습니다(그림 5). 처리 후 PANI/PLA 나노섬유의 접촉각이 유의미하게 감소했습니다. PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA의 접촉각은 각각 112°, 61.6°, 36.7°, 37.2°였습니다. PANI/PLA의 PANI 형상이 시스템 표면 에너지를 증가시키고, 물과 최초 접촉 시 접촉 면적이 늘어나 접촉각이 감소하고 습윤성이 개선되었습니다. 복합 나노섬유의 접촉각은 물과 5초 접촉 후 0°로 변해 우수한 친수성을 보였습니다. 이 친수성 스캐폴드는 세포 부착과 확산에 유리한 조건을 제공합니다[37]. 플라즈마 처리 후 PLA 표면의 산소 함유 관능기(예: -OH, -COOH)가 나노섬유 표면에 더 많이 결합했고, PANI 형상과 산소 함유 관능기가 함께 작용해 PANI/PLA 복합 나노섬유가 최종적으로 완전히 젖게 되었습니다[38, 39].

a PLA 나노섬유, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA 복합 나노섬유의 접촉각

순수 PANI와 서로 다른 무기산으로 도핑된 PANI/PLA 복합 나노섬유의 FTIR 스펙트럼을 그림 6에 나타냈습니다. 순수 도핑 PANI 스펙트럼(그림 6a)에서 1,565, 1,485, 1,298, 1,125 cm⁻¹의 강한 특성 피크는 각각 퀴노이드 고리의 C=C 신축, 벤조이드 고리의 C=C 신축, C-N 신축, =C-H 신축에 대응합니다. 순수 도핑 PANI 스펙트럼(그림 6b)에서는 PANI 특성 피크 외에 PLA 피크도 관찰됩니다(C-O 신축 진동 피크 1092, 1184 cm⁻¹, C=O 신축 진동 피크 1757 cm⁻¹). 이 결과들은 무기산으로 도핑된 PANI/PLA 나노섬유 표면에 PANI이 성공적으로 적재되었음을 나타냅니다. PANI/PLA 나노섬유의 화학 조성을 더 조사하기 위해 XPS로 표면 조성을 분석했습니다. 또한 XPS 스펙트럼(그림 7a)에서 PANI/PLA 복합 나노섬유에서 ~400 eV에서 명확한 N1s 피크가 관찰되었습니다. PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-PA에서 ~200 eV에서 Cl2p 피크가 보였으며, PANI/PLA-PA의 Cl2p 피크 강도가 PANI/PLA-HA보다 높았습니다. PANI/PLA-SA의 XPS 스펙트럼에서 ~210 eV에 S2p 피크가 나타났습니다. XPS 스펙트럼은 Cl⁻, SO₄²⁻, ClO₄⁻가 해당 PANI/PLA 나노섬유에 도핑되었음을 보여줍니다. 또한 PANI의 이미노 질소 원자가 완전히 또는 부분적으로 산화되어 다양한 산화 상태와 양성화도를 동반했습니다. 산화 상태와 양성화도 변화는 N1s 핵수준 스펙트럼(그림 7b-d)으로 측정했습니다. 각 N1s 스펙트럼은 약 398.7, 399.6, 400.4, 401.8 eV 결합 에너지를 가진 네 가지 주요 성분으로 분해될 수 있으며, 각각 퀴노이드 이미노(-N=), 벤조이드 아미노(-NH-), 양성화 아민(-N⁺), 양성화 이미노(=N⁺)에 기인합니다[40, 41]. Kumar 연구[42]에 따르면 N1s 스펙트럼 피팅 피크는 양성화된 N 원자에 결합된 음이온의 전하 영향을 받아 비국소화와 미세한 이동이 발생합니다.

FTIR 스펙트럼: a PANI, b PLA와 PANI/PLA 복합 나노섬유

제조된 PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드의 XPS 스펙트럼(a)과 PANI/PLA-HA(b), PANI/PLA-SA(c), PANI/PLA-PA(d)의 N1s 핵수준 신호

생체 활성 스캐폴드는 유도된 세포 및 조직 복구 후 체내에서 분해되고 배설되는 조직 복구 및 재생의 템플릿입니다[43]. 본 논문에서는 질량 손실법으로 나노섬유 스캐폴드의 분해 특성을 평가했습니다(그림 8). 모든 시료의 질량 손실이 7, 14, 21일째에 증가했습니다. PLA 나노섬유의 질량 손실률은 각각 4.34 ± 0.41%, 7.84 ± 1.57%, 12.65 ± 0.83%였습니다. 한편 PANI/PLA-PA 복합 나노섬유의 질량 손실은 현장 산화 중합 후 점차 증가해 7, 14, 21일째 각각 31 ± 2.15%, 34 ± 1.86%, 40 ± 2.54%로, PANI/PLA-HA와 PANI/PLA-SA 나노섬유보다 유의미하게 높았습니다. PANI 현장 산화 중합 공정에서 산화제 APS가 PLA의 에스테르 결합을 파괴하고 가수분해 반응을 유도해 PLA 나노섬유에 미세 균열을 생성했을 수 있습니다. PBS 침지 시간이 길어짐에 따라 미세 균열이 점차 누적되고 PLA 기질이 점차 분해되기 시작했습니다. 표면에 적재된 PANI도 탈락해 나노섬유 질량 손실률이 발생했습니다. 시간이 지남에 따라 질량 손실 비율이 더 명확해졌습니다. 여기서 HClO₄의 강한 산화가 PLA 분해를 악화시키고 PANI/PLA-PA 나노섬유의 질량 손실을 가속화했으며, 이는 그림 2의 기계적 특성과 일치합니다.

PLA와 PANI/PLA 나노섬유의 분해 특성

생체 활성 스캐폴드의 생체적합성은 세포 부착, 성장, 증식 촉진의 기초입니다[44]. 본 연구에서는 HOS 세포의 PLA와 PANI/PLA 복합 나노섬유 상에서의 증식을 연구해 부착과 생체적합성을 입증했습니다. 화학적 처리와 기능화[45] 과정에서 생체 활성 스캐폴드 제조 시 여러 잠재적 영향 인자가 작용할 수 있습니다. 따라서 생체적합성 조사가 실제 적용성 평가의 핵심입니다.

PANI/PLA 복합 나노섬유의 생체적합성을 조사하기 위해 MTT 법으로 세포 생존율을 평가했습니다. 그림 9는 1, 3, 5일 후 PLA와 PANI/PLA 복합 나노섬유 상에서 배양된 HOS 세포 활성을 보여줍니다. 배양 시간이 길어짐에 따라 나노섬유의 세포 활성이 점차 증가했으며, PANI/PLA-PA 세포가 가장 우수한 활성을 보였고 5일 배양 후 세포 활성이 가장 높았습니다.

PLA 나노섬유와 PANI/PLA 복합 나노섬유 상에서 1, 3, 5일 배양된 HOS 세포 생존율 (*p < 0.05; **p < 0.005)

PLA는 생분해성이지만 소수성이라 세포 부착, 성장, 증식에 불리합니다. 플라즈마 처리 후 PANI/PLA 복합 나노섬유 표면에 산소 함유 기가 적재되고 기능성 표면이 우수한 친수성을 보였습니다. 위 형상과 AFM 결과에서 서로 다른 무기산으로 도핑된 PANI이 PLA 나노섬유 표면에서 서로 다른 형상과 거칠기를 보임을 알 수 있습니다. 한편 PANI/PLA 복합 나노섬유는 우수한 습윤성을 보였습니다. 따라서 서로 다른 무기산으로 도핑된 PANI 형상이 PANI/PLA 복합 나노섬유의 표면 에너지와 극성을 증진시켜 세포 성장, 이동, 증식에 영향을 미쳐 세포 활성 측면에서 성능을 개선했다고 판단했습니다[46].

PANI/PLA 복합 나노섬유의 세포 행동을 더 연구하기 위해 형광 면역 염색(그림 10)과 SEM(그림 11)으로 나노섬유 상의 세포 성장과 부착을 관찰했습니다. 여기서는 서로 다른 나노섬유 표면의 액틴과 세포 형상을 비교했습니다. 세포가 PLA 섬유와 PANI/PLA 나노섬유에서 자랄 때 액틴 다발이 좋은 신장 상태를 보였습니다. 한편 PANI/PLA 복합 나노섬유의 세포 밀도가 대조군 PLA 나노섬유보다 높았으며, 세포 성장 밀도 순서는 PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA였습니다. HOS 세포는 PANI/PLA 나노섬유에서 평평한 다극 형태로 부착해 성장했습니다. 명확히 많은 세포가 PANI/PLA 섬유 기공에 파묻혀 있는 반면, PLA 나노섬유에서는 잘 신장되지 못해 완전히 확장되지 못했습니다. 이 결과들은 PANI/PLA 복합 나노섬유가 HOS 세포의 부착과 증식을 촉진할 수 있음을 나타냅니다.

24시간 배양 후 a PLA 나노섬유, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA 복합 나노섬유의 형광 현미경 이미지

24시간 후 a PLA 나노섬유, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA 복합 나노섬유에 접종된 HOS 세포의 SEM 미세 사진

한편 세포 면역 형광 염색과 세포 부착 결과는 PANI/PLA 복합 나노섬유 표면의 서로 다른 PANI 형상이 HOS 세포의 성장, 부착, 증식에 영향을 미침을 보여주며, 이는 위 결과와 일치합니다.

초기 골형성 표지자로서 PLA와 PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드에 대해 7일간 ALP 시험을 수행했습니다. 순수 PLA 나노섬유 대비 그림 12 결과에서 PANI/PLA 복합 나노섬유에서 ALP 활성이 유의미하게 향상됨을 보였습니다. 명백히 PANI/PLA-PA 복합 나노섬유의 ALP 활성이 가장 우수했습니다. 이 결과들은 PANI/PLA 복합 나노섬유가 더 우수한 생체적합성을 보임을 입증하며, 이는 위 세포 부착, 성장, 증식 결과와 일치합니다.

PANI/PLA 복합 나노섬유 스캐폴드 상의 알칼리 포스파타제 활성 (ns = 유의미하지 않음)

결론

본 논문에서는 현장 중합에서 세 가지 무기산을 도펀트로 사용해 서로 다른 표면 형상을 가진 PANI/PLA 복합 나노섬유를 제조했습니다. PANI이 나노섬유 다공성 구조 변화 없이 PLA 표면에 성공적으로 적재됨을 확인했습니다. 기계적 특성과 체외 분해 실험에서 산화성 산이 폴리에스테르 나노섬유의 기계적 특성을 크게 약화시키고 분해를 가속화함을 입증했습니다. 한편 더 거친 표면이 더 나은 습윤성을 가져오고 세포 부착, 성장, 증식을 촉진해 더 우수한 생체적합성을 나타냈습니다. 결론적으로, 다양한 산 도핑을 통한 조절된 PANI 형상은 조직 공학에서 생체적합성에 긍정적 영향을 미칩니다.

데이터 및 재료 가용성

저자들은 재료와 데이터가 독자들에게 부당한 자격 요건 없이 즉시 이용 가능함을 선언합니다. 본 연구에서 생성되거나 분석된 모든 데이터는 본 논문에 포함되어 있습니다.

약어

PANI:

폴리아닐린 (Polyaniline)

PLA:

폴리락트산 (Polylactic acid)

ECM:

세포외 기질 (Extracellular matrix)

PPy:

폴리피롤 (Polypyrrole)

PTH:

폴리티오펜 (Polythiophene)

AN:

아닐린 (Aniline)

DCM:

디클로로메탄 (Dichloromethane)

DMF:

N,N-디메틸포름아미드 (N,N-Dimethylformamide)

APS:

과황산암모늄 (Ammonium persulfate)

HOS:

인간 골육종 세포 (Human osteosarcoma cells)

DMEM:

둘베코 변성 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium)

PBS:

인산염 완충 식염수 (Phosphate buffer saline)

MTT:

3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드

FITC:

플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate)

FTIR:

푸리에 변환 적외선 분광법 (Fourier transform infrared spectroscopy)

FE-SEM:

전계 방출 주사 전자 현미경 (Field emission scanning electron microscopy)

XPS:

X선 광전자 분광법 (X-ray photoelectron spectroscopy)

ALP:

알칼리 포스파타제 (Alkaline phosphatase)