miR-301 표적 억제로 PTEN 활성화해 식도 편평상피암에서 혈관신생과 종양 성장 억제

초록

목적

식도 편평상피암(ESCC)은 조기 전이와 늦은 진단이 특징입니다. 마이크로RNA-301(miR-301)은 다양한 암에 관여하는 것으로 알려져 있으나, ESCC에서의 효과는 미탐구 상태입니다. 따라서 본 연구는 miR-301이 ESCC 진행에 미치는 역할을 탐구하는 것을 목표로 합니다.

방법

ESCC 조직과 세포주에서 miR-301과 인산화효소 및 텐신 동종체(PTEN) 발현을 평가했습니다. 다음으로 선별된 세포를 변형된 miR-301 또는 PTEN 올리고뉴클레오티드와 플라스미드로 처리하고, ESCC 세포의 집락 형성 능력, 세포 생존율, 이동, 침윤, 세포 주기 분포, 세포자멸사를 평가했습니다. 또한 종양 성장과 미세혈관 밀도(MVD)도 평가했으며, miR-301과 PTEN 간 표적 관계를 확인했습니다.

결과

ESCC 조직과 세포에서 miR-301은 상향 조절되고 PTEN은 하향 조절되었습니다. 기능 분석을 위해 KYSE30 세포와 Eca109 세포를 선정했습니다. KYSE30 세포에서 miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 세포 악성 행동을 억제했으며, PTEN 침묵이 miR-301 억제의 ESCC 진행에 대한 영향을 제거했습니다. Eca109 세포에서 miR-301 과발현 또는 PTEN 억제가 세포 악성 행동을 촉진했으며, PTEN 과발현이 miR-301 상향의 ESCC 진행에 대한 효과를 역전시켰습니다. 체내 실험에서 miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 종양 성장과 MVD를 억제했고, miR-301 상향 또는 PTEN 감소는 반대 효과를 보였습니다. 또한 PTEN이 miR-301의 표적임이 확인되었습니다.

결론

종합하면, 본 연구 결과는 miR-301이 PTEN 발현 조절을 통해 ESCC에서 세포 성장, 전이, 혈관신생에 영향을 미침을 밝혀냈습니다.

서론

식도암(EC)은 전 세계적으로 8번째로 흔한 암으로, 높은 사망률과 불량한 예후를 보이는 치명적인 악성 종양입니다[1]. 전체 EC 증례의 약 90%를 차지하는 식도 편평상피암(ESCC)은 중국에서 EC의 주요 형태입니다[2]. 낮은 사회경제적 지위, 흡연, 음주, 영양 섭취 불량, 니트로사민 풍부 또는 곰팡이 독소 오염 식품 등 다양한 원인이 ESCC 발생을 유발합니다[3]. 임상 결과와 치료법이 개선되었음에도 불구하고 ESCC 환자의 예후는 여전히 나쁘며, 5년 생존율은 15-25%입니다[4]. 따라서 ESCC 발달에서 바이오마커로 기능할 수 있는 온코진이나 종양 억제 유전자를 확인해 ESCC 환자에게 더 효과적인 치료법을 제공하는 것이 중요합니다.

마이크로RNA(miRNA)는 유전자 발현 조절에 필수적인 역할을 하는 작은 비암호화 RNA입니다[5] 그리고 mRNA 안정성과 mRNA 능력을 조절해 종양 진행에 영향을 미치는 능력이 입증되었습니다[6]. miR-4324[7], miR-889-3p[8], miR-9[9] 등 다수의 miRNA가 ESCC 과정과 연관됨이 밝혀졌습니다. miR-301은 인간 게놈 17q22-23에 위치한 fam33a 전사 단위에 의해 형성되는 miRNA 계열의 일원입니다. miR-301의 과발현이 이전에 확인되어 인간 질환에 관여함이 반영되었습니다[6, 10]. 그러나 miR-301의 기능 메커니즘은 ESCC에서 밝혀지지 않았습니다. 또한 인산화효소 및 텐신 동종체(PTEN)는 종양에서 빈번하게 교란되며 암 환자의 생식계 돌연변이에 의해 표적화되어 종양 억제 역할을 합니다[11]. PTEN 조절 장애가 ESCC 발달과 연관됨이 검증되었습니다[12]. 흥미롭게도 최근 연구에서 miR-301이 비소세포폐암에서 PTEN을 표적화함이 밝혀졌습니다[13]. 그러나 miR-301과 PTEN 간 표적 관계가 ESCC 발달에서 밝혀져야 합니다. 본 연구는 ESCC 진행에서 miR-301과 PTEN의 효과에 초점을 맞췄으며, 이는 largely unknown하고 참신합니다. miR-301이 PTEN 발현 조절을 통해 ESCC에서 혈관신생과 세포 성장에 영향을 미칠 것으로 추론했습니다.

재료 및 방법

윤리 선언

연구 전 모든 환자로부터 서면 동의를 얻었습니다. 본 연구 프로토콜은 헬싱키 선언의 인간 대상 의학 연구 윤리 원칙에 기반해 지린대학교 제2병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 동물 실험은 국립보건원 발행 실험동물 관리 및 사용 지침을 엄격히 준수했습니다. 동물 실험 프로토콜은 지린대학교 제2병원 실험동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

연구 대상

2015년 1월부터 2017년 12월까지 지린대학교 제2병원 흉부외과에서 식도절제술을 받은 ESCC 환자(남성 78명, 여성 32명)로부터 110례의 ESCC 조직과 인접 정상 조직(종양에서 >5 cm)을 수집했습니다. 110명 환자 중 84례가 >60세, 26례가 ≤60세; 종양 크기: 65례 ≥5 cm, 45례 <5 cm; 71례 림프절 전이(LNM) 없음, 39례 LNM 있음; 종양-림프절-전이(TNM) 병기: 60례 I+II기, 50례 III기; 종양 위치: 13례 상부 ESCC, 97례 중하부 ESCC. 모든 환자는 ESCC로 진단받았으며 수술 전 방사선 치료나 화학 요법을 받지 않았습니다. 종양은 완전히 절제되었고, 병리학적으로 음성 수술 마진이 확인되었습니다. 2009년 국제암대책연합(UICC)이 제안한 ESCC 병기 기준[14]에 따라 환자의 수술 후 병리학적 병기는 pT1-4N1-2(I-IIIb)기로 확인되었습니다. 수술 후 유의한 합병증이 없었고, 수술 주위 사망례는 제외되었습니다.

역전사 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

조직과 세포의 총 RNA를 Trizol 키트(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)로 추출했습니다. RNA 농도와 품질을 측정했습니다. RNA 프라이머(표 1)는 타카라 바이오테크놀로지사(랴오닝, 중국)에서 설계 및 합성했습니다. 타카라 PrimeScript™ RT 시약 키트(gDNA Eraser 포함) 지침에 따라 RNA를 cDNA로 역전사했습니다. Light Cycler 480II(Roche)에서 Power PCR SYBR green PCR 마스터 믹스(타카라)를 사용해 qPCR을 수행했습니다. U6을 miR-301의 로딩 컨트롤로, β-actin을 PTEN의 내부 기준으로 사용했습니다. 데이터는 2^−△△Ct 법으로 분석했습니다[15].

웨스턴 블롯 분석

RIPA 용해 버퍼(베요타임 생물공학연구소, 상하이, 중국)로 세포와 조직의 총 단백질을 추출하고, BCA 단백질 분석 키트(베요타임)로 정량했습니다. 각 시료의 단백질 농도를 측정하고 10% SDS-PAGE를 수행했습니다. 시료를 니트로셀룰로오스 막으로 전이하고 5% 탈지분유로 4°C에서 하룻밤 차단했습니다. 이후 1차 항체 PTEN과 β-actin(둘 다 1:500, 산타크루즈 바이오테크놀로지, CA, USA)을 첨가해 하룻밤 배양한 후 2차 항체를 첨가해 1시간 배양했습니다. 향상된 화학발광 시약(피어스 케미칼, 댈러스, TX, USA)에 1분간 담근 후 암실에서 노출하고 LAS4000 미니 화학발광 이미저로 현상했습니다. 회색 값은 β-actin을 대조로 이미징 시스템 소프트웨어로 평가해 최종 상대 단백질 발현량을 얻었습니다. 단백질 밴드는 ImageJ2x 소프트웨어로 분석했습니다.

이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석

PTEN의 3'-비번역 영역(UTR) 서열이 miR-301과 상호작용할 것으로 예측되거나, 예측된 표적 부위 내 돌연변이 서열을 합성해 pGL3 대조 루시퍼라제 리포터 벡터(프로메가, WI, USA)의 XbaI와 FseI 부위에 삽입했습니다. 이어서 pGL3-PTEN-wt와 pGL3-PTEN-mut 벡터를 제작했습니다. 정확히 확인된 wt와 mut 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 miR-301 mimic과 mimic NC와 함께 KYSE30과 Eca109 세포에 48시간 공동 형질주입했습니다. 이후 세포를 용해시키고 루시퍼라제 검출 키트(프로메가)로 루시퍼라제 활성을 각각 측정했습니다.

세포 배양, 그룹 분류 및 형질주입

ESCC 세포주(KYSE-150, KYSE-30, Eca109, KYSE-70)는 중국과학원 상하이 생화학 및 세포생물학연구소(상하이, 중국)에서, 인간 식도 상피 세포(HEEC)는 명주 바이오테크놀로지사(저장, 중국)에서 얻었습니다. 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS, 라이프 테크놀로지, USA), 100 units/ml 페니실린 G 나트륨(시그마), 100 μg/ml 스트렙토마이신 황산염(시그마)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Invitrogen)에서 배양했습니다. 각 세포주에서 miR-301 발현과 PTEN mRNA 발현을 RT-qPCR로 측정하고, 상대 발현이 가장 높고 낮은 세포주를 후속 세포 실험에 선정했습니다.

KYSE-30 세포를 7개 그룹으로 나누고 각각 miR-301 inhibitor, inhibitor negative control(NC), pcDNA-PTEN(oe-PTEN으로 명명), pcDNA-NC(oe-NC로 명명), miR-301 inhibitor + small interfering RNA(si)-PTEN 또는 miR-301 inhibitor + si-NC로 처리했습니다. Eca109 세포도 7개 그룹으로 나누고 각각 miR-301 mimic, mimic NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimic + oe-PTEN, miR-301 mimic + oe-NC로 처리했습니다. inhibitor NC, miR-301 inhibitor, miR-301 mimic, mimic NC, si-NC, si-PTEN은 GenePharma Ltd.(상하이, 중국)에서 구입했습니다; pcDNA-PTEN NC와 pcDNA-PTEN은 상하이 상공 바이오테크놀로지사(상하이, 중국)에서 얻었습니다. 세포 융합도가 60%에 도달하면 리포펙타민 2000(Invitrogen)으로 ESCC 세포에 일시적으로 형질주입했습니다.

세포 계수 키트(CCK-8) 분석

세포를 96웰 플레이트(1 × 10³ cells/well)에 접종하고 다른 시간 동안 배양했습니다. 24, 48, 72, 96시간 배양 후 각 웰에 10 μL CCK-8 용액(5 mg/mL)을 첨가하고 37°C에서 차광 하에 2시간 배양했습니다. 450 nm에서 광학 밀도(OD) 값을 마이크로플레이트 리더(바이오래드, 허큘리스, CA, USA)로 분석했습니다.

집락 형성 분석

형질주입 후 세포를 6웰 플레이트에 500 cells/well로 접종하고 14일간 배양했습니다. 집락을 메탄올로 고정하고 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 역위 현미경으로 계수했습니다.

트랜스웰 분석

RPMI 1640 배지에서 배양된 세포(5 × 10³)를 비코팅 또는 매트리겔 코팅 막(코닝, NY, USA)이 있는 트랜스웰 장치 상부 챔버에 접종했습니다. 24시간 후 상부 챔버의 세포를 제거하고, 하부에 남은 세포를 고정한 후 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색했습니다. 현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)으로 3개 무작위 시야를 계수해 세포 수를 계산했습니다.

유세포 분석

세포 주기와 세포자멸사를 유세포 분석으로 평가했습니다. Annexin V-플루오레세인 이소티오시아네이트(10 µL)와 요오드화 프로피듐(PI; 5 µL, 시그마)을 세포(5 × 10⁵ cells/well)와 함께 4°C에서 30분간 차광 배양했습니다. 유세포 분석기(BD 바이오사이언스, CA, USA)와 FlowJo 버전 10 소프트웨어(FlowJo LLC, OR, USA)로 세포자멸사 비율을 계산했습니다.

세포 주기 평가를 위해 세포(5 × 10⁵ cells/well)를 75% 에탄올로 4°C에서 하룻밤 고정하고, 5 µl PI/리보누클레아제 A(시그마)로 4°C에서 30분간 차광 염색했습니다. 데이터는 유세포 분석기(BD 바이오사이언스)로 분석했습니다. 각 시료의 형광 신호(14,000)를 수집해 ModFit LT 버전 3.2 소프트웨어(Verity Software House, Inc., ME, USA)로 계산했습니다.

누드 마우스 피하 종양 형성

4주령, 16-24 g 체중의 암컷 BALB/c-nu 누드 마우스 42마리를 지린대학교 실험동물센터(장춘, 중국)에서 얻었습니다. 누드 마우스를 14개 그룹(n=3)으로 나눴습니다. 7개 그룹의 누드 마우스에는 세포 그룹 분류에 따라 KYSE-30 세포를, 나머지 7개 그룹에는 Eca109 세포를 각각 피하 주입했습니다. 형질주입된 KYSE-30과 Eca109 세포 농도를 5 × 10⁶ cells/100 μL로 조절했습니다. 누드 마우스를 고정하고 멸균 조건에서 해당 ESCC 세포를 피하 주입했습니다. 매주 종양의 최대 길이(L)와 너비(W)를 측정하고 종양 부피(V) = 1/2 × L × W²로 계산했습니다. 주입 5주차에 누드 마우스를 안락사시키고 종양을 적출해 무게를 측정하고 촬영했습니다. 종양 형성률 = 피하 종양이 생긴 마우스 수/주입된 총 누드 마우스 수 × 100%로 계산했습니다. 주입 시간을 가로축, 종양 크기를 세로축으로 해 종양 성장 곡선을 그렸습니다.

면역조직화학 염색

누드 마우스의 종양 조직을 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀 포매 후 4 μm 두께로 절편했습니다. 60°C에서 2시간 건조하고 자일렌으로 탈파라핀, 에탄올 농도 구배로 탈수 후 50 μL 3% H₂O₂로 10분 처리했습니다. 이후 0.01 M 시트르산 완충액에 담그고 95°C에서 20분 끓인 후 정상 염소 혈청 작업 용액으로 37°C에서 10분 차단하고 CD₃₄(1:100, 산타크루즈)를 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 이후 HRP 표지 항토끼/마우스 IgG 중합체(ZSGB-Bio, 베이징, 중국)를 첨가하고 헤마톡실린으로 대조 염색, 탈수 및 투명화 후 중성 발삼으로 봉입했습니다. 1차 항체를 PBS로 대체해 음성 대조로 했습니다. 미세혈관 밀도(MVD) 측정: 저배율 현미경으로 관찰했습니다. 갈색으로 염색되고 주변 종양 세포와 결합 조직과 명확히 구별되는 내피 세포 또는 내피 세포 군을 미세혈관으로 간주했습니다. 분지 구조도 분리된 경우 혈관으로 간주했으며, 루멘 크기 >8 적혈구, 근육층 또는 더 두꺼운 루멘을 가진 혈관은 제외했습니다. 3개 고배율 시야의 미세혈관 수를 기록하고 평균값을 각 증례의 MVD로 했습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 SPSS 버전 21.0 소프트웨어(IBM Corp., 아몬크, NY, USA)로 수행하고 Graphpad Prism Software 6.0으로 나타냈습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현했습니다. 두 독립 그룹 간 차이는 Student's t-test로 검정했습니다. 세 그룹 이상 비교에는 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행했습니다. P 값 < 0.05를 통계적으로 유의한 차이로 간주했습니다.

결과

ESCC 조직과 세포에서 miR-301 고발현, PTEN 저발현

ESCC 조직과 인접 정상 조직에서 miR-301과 PTEN 발현을 RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 평가해 ESCC에서의 역할을 밝혔습니다. 그 결과(그림 1a-c) ESCC 조직에서 miR-301은 상향 조절되고 PTEN은 하향 조절되었습니다. 환자들을 miR-301 또는 PTEN 발현 중앙값에 따라 저발현군과 고발현군으로 나누어 miR-301/PTEN 발현과 ESCC 환자의 임상병리학적 특성 간 상관관계를 분석했습니다. 결과는 miR-301/PTEN 발현이 연령, 성별, 종양 크기, 위치, 분화도와는 관련이 없으나, ESCC 환자의 TNM 병기와 LNM과는 상관관계가 있음을 보여주었습니다(표 2).

ESCC 조직과 세포에서 miR-301 고발현, PTEN 저발현. a RT-qPCR로 측정한 ESCC 조직 내 miR-301 발현과 PTEN mRNA 발현; b 웨스턴 블롯으로 측정한 ESCC 조직 내 PTEN 단백질 발현; c 웨스턴 블롯에서 ESCC 조직의 PTEN 단백질 밴드; d RT-qPCR로 측정한 ESCC 세포주 내 miR-301 발현과 PTEN mRNA 발현; e 웨스턴 블롯으로 측정한 ESCC 세포주 내 PTEN 단백질 발현; f 웨스턴 블롯에서 ESCC 세포주의 PTEN 단백질 밴드. *P < 0.05 vs. HEEC. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 두 그룹 간 비교에 t-test 수행

이어서 4개 ESCC 세포주와 HEEC에서 miR-301과 PTEN 발현을 RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 측정했습니다. ESCC 세포주에서 miR-301이 상향 조절되고 PTEN이 하향 조절됨을 확인했습니다(그림 1d-f). 그중 KYSE-30이 가장 높은 miR-301 발현과 가장 낮은 PTEN 발현을 보였고, Eca109는 반대 경향을 보였습니다. 따라서 세포 실험에서 KYSE-30 세포주는 miR-301 하향 조절/PTEN 과발현 처리, Eca109 세포주는 miR-301 과발현/PTEN 침묵 처리를 했습니다.

PTEN은 miR-301의 표적 유전자

생물정보학 소프트웨어(https://www.microrna.org/)가 PTEN을 miR-301의 표적 유전자로 예측했습니다(그림 2a). 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 추가 확인한 결과, PTEN-wt 벡터와 miR-301 mimic을 공동 형질주입한 ESCC 세포에서 PTEN-mut 벡터와 miR-301 mimic 공동 형질주입 세포에 비해 루시퍼라제 활성이 유의미하게 감소해, miR-301이 PTEN에 특이적으로 결합할 수 있음을 시사했습니다(그림 2b, c).

PTEN은 miR-301의 표적 유전자. a 온라인 예측 소프트웨어로 예측된 miR-301과 PTEN 결합 부위; b KYSE-30 세포에서 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 평가된 miR-301과 PTEN 표적 관계; c Eca109 세포에서 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 평가된 miR-301과 PTEN 표적 관계; d miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 RT-qPCR로 측정한 KYSE-30 세포 내 miR-301 발현과 PTEN mRNA 발현; e miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 웨스턴 블롯으로 측정한 KYSE-30 세포 내 PTEN 단백질 발현; f miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 웨스턴 블롯에서 KYSE-30 세포의 PTEN 단백질 밴드; g miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 RT-qPCR로 측정한 Eca109 세포 내 miR-301 발현과 PTEN mRNA 발현; h miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 웨스턴 블롯으로 측정한 Eca109 세포 내 PTEN 단백질 발현; i miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 웨스턴 블롯에서 Eca109 세포의 PTEN 단백질 밴드. *P < 0.05 vs. inhibitor-NC 그룹, & P < 0.05 vs. oe-NC 그룹, ^#P < 0.05 vs. miR-301 inhibitor + si-NC 그룹, a P < 0.05 vs. mimic-NC 그룹, b P < 0.05 vs. si-NC 그룹, c P < 0.05 vs. miR-301 mimic + oe-NC 그룹; N = 3. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 두 그룹 간 비교에 t-test, 다중 그룹 비교에 ANOVA 사용

RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 형질주입된 세포에서 miR-301과 PTEN 발현을 평가했습니다. KYSE-30 세포에서(그림 2d-f) miR-301 inhibitor 처리 세포는 miR-301을 하향 조절시키고 PTEN을 상향 조절시켰으며, pcDNA-PTEN(oe-PTEN) 처리 세포는 PTEN 발현을 증가시켰고, si-PTEN은 miR-301 inhibitor의 PTEN 발현에 대한 효과를 역전시켰습니다. Eca109 세포에서(그림 2g-i) miR-301 mimic 처리 세포는 miR-301을 상향 조절시키고 PTEN을 하향 조절시켰으며, si-PTEN 처리 세포는 PTEN 발현을 감소시켰고, pcDNA-PTEN(oe-PTEN)은 miR-301 mimic의 PTEN 발현 억제 역할을 역전시켰습니다. 이 데이터들은 miR-301이 PTEN을 표적화함을 시사합니다.

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 생존율 억제; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 세포 생존율 촉진

ESCC 세포 생존율을 집락 형성과 CCK-8 분석으로 평가했습니다. 결과에 따르면 KYSE-30 세포주에서(그림 3a-c) miR-301 inhibitor 또는 oe-PTEN 형질주입이 집락 형성 능력과 세포 생존율을 억제했습니다; si-PTEN 형질주입이 miR-301 inhibitor의 ESCC 세포 생존율에 대한 영향을 제거했습니다. Eca109 세포주에서(그림 3d-f) miR-301 mimic 또는 si-PTEN 형질주입이 집락 형성 능력과 세포 생존율을 촉진했습니다; PTEN 과발현이 miR-301 상향의 Eca109 세포 집락 형성 능력과 생존율 촉진 역할을 역전시켰습니다. 이 결과들은 miR-301 녹다운 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 생존율을 억제하며, 이는 miR-301 상향 또는 PTEN 억제에 의해 촉진됨을 시사합니다.

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 생존율 제한; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 세포 생존율 촉진. a miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 집락 형성 분석으로 측정한 KYSE-30 세포 집락 수; b miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 집락 형성 분석으로 측정한 KYSE-30 세포 집락 형성 능력; c miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 CCK-8 분석으로 측정한 KYSE-30 세포 생존율; d miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 집락 형성 분석으로 측정한 Eca109 세포 집락 수; e miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 집락 형성 분석으로 측정한 Eca109 세포 집락 형성 능력; f miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 CCK-8 분석으로 측정한 Eca109 세포 생존율; *P < 0.05 vs. inhibitor-NC 그룹; & P < 0.05 vs. oe-NC 그룹; ^#P < 0.05 vs. miR-301 inhibitor + si-NC 그룹; a P < 0.05 vs. mimic-NC 그룹; b P < 0.05 vs. si-NC 그룹; c P < 0.05 vs. miR-301 mimic + oe-NC 그룹, N = 3. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 다중 그룹 비교에 ANOVA 사용

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 이동과 침윤 억제; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 세포 이동과 침윤 유도

ESCC 세포의 이동과 침윤 능력을 트랜스웰 분석으로 평가했습니다. 결과에 따르면 KYSE-30 세포주에서(그림 4a, b) miR-301 억제 또는 PTEN 과발현으로 세포 이동과 침윤 능력이 억제되었습니다; miR-301 inhibitor의 세포 이동과 침윤 능력 억제 역할이 si-PTEN에 의해 역전되었습니다. Eca109 세포주에서(그림 4c, d) miR-301 mimic 또는 si-PTEN 형질주입 후 세포 이동과 침윤 능력이 촉진되었습니다; PTEN 과발현이 miR-301 mimic의 세포 이동과 침윤 능력에 대한 영향을 역전시켰습니다. 위 결과들은 ESCC 세포의 이동과 침윤이 miR-301 억제 또는 PTEN 상향에 의해 억제되며, miR-301 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절에 의해 촉진됨을 시사합니다.

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 이동과 침윤 억제; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 세포 이동과 침윤 촉진. a miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 트랜스웰 분석으로 평가된 형질주입 KYSE-30 세포의 이동과 침윤 능력; b miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 트랜스웰 분석으로 측정한 KYSE-30 세포의 이동 및 침윤 통계 결과; c miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 트랜스웰 분석으로 평가된 Eca109 세포 그룹 간 이동과 침윤 능력; d miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 트랜스웰 분석으로 측정한 Eca109 세포의 이동 및 침윤 통계 결과. *P < 0.05 vs. inhibitor-NC 그룹; & P < 0.05 vs. oe-NC 그룹; ^#P < 0.05 vs. miR-301 inhibitor + si-NC 그룹; a P < 0.05 vs. mimic-NC 그룹; b P < 0.05 vs. si-NC 그룹; c P < 0.05 vs. miR-301 mimic + oe-NC 그룹, N = 3. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 다중 그룹 비교에 ANOVA 사용

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 주기 정지와 세포자멸사 유도; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 세포 주기 정지와 세포자멸사 억제

형질주입 후 세포 주기 이행과 세포자멸사를 유세포 분석으로 검출했습니다. 결과에 따르면 KYSE-30 세포주에서(그림 5a-d) miR-301 inhibitor 또는 oe-PTEN 형질주입이 세포자멸사율을 촉진하고 G0/G1기 세포 비율을 증가시켰으며, S기와 G2/M기 세포 비율을 감소시켰습니다; miR-301 inhibitor에 의해 유도된 세포자멸사와 세포 주기 정지 변화가 si-PTEN에 의해 역전될 수 있었습니다.

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포 주기 정지와 세포자멸사 유도; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 세포 주기 정지와 세포자멸사 억제. a miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 유세포 분석으로 검출된 KYSE-30 세포 그룹별 세포 주기 분포; b miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 유세포 분석으로 측정한 KYSE-30 세포의 G0/G1, S, G2/GM기 비율 통계 결과; c miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 유세포 분석으로 검출된 KYSE-30 세포의 세포자멸사; d miR-310 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 유세포 분석으로 측정한 형질주입 KYSE-30 세포의 세포자멸사율; e miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 유세포 분석으로 검출된 Eca109 세포 그룹별 세포 주기 분포; f miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 유세포 분석으로 측정한 Eca109 세포의 G0/G1, S, G2/GM기 비율 통계 결과; g miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 유세포 분석으로 검출된 Eca109 세포의 세포자멸사; h miR-310 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 유세포 분석으로 측정한 형질주입 Eca109 세포의 세포자멸사율. *P < 0.05 vs. inhibitor-NC 그룹; & P < 0.05 vs. oe-NC 그룹; ^#P < 0.05 vs. miR-301 inhibitor + si-NC 그룹; a P < 0.05 vs. mimic-NC 그룹; b P < 0.05 vs. si-NC 그룹; c P < 0.05 vs. miR-301 mimic + oe-NC 그룹, N = 3. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 다중 그룹 비교에 ANOVA 사용

유세포 분석 결과에 따르면 Eca109 세포주에서(그림 5e-h) miR-301 mimic 또는 si-PTEN 형질주입이 세포자멸사율을 억제하고 G0/G1기 세포 비율을 감소시켰으며, S기와 G2/M기 비율을 증가시켰습니다; PTEN 과발현이 miR-301 mimic의 Eca109 세포 세포자멸사율과 세포 주기 정지에 대한 효과를 역전시켰습니다. 이 결과들로부터 miR-301 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절이 ESCC 세포에서 세포 주기 이행과 세포자멸사를 촉진하며, miR-301 억제 또는 PTEN 침묵이 반대 효과를 가짐을 결론지었습니다.

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 체내에서 ESCC 종양 성장과 혈관신생 억제; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 체내에서 ESCC 종양 성장과 혈관신생 증가

각 그룹에서 누드 마우스의 ESCC 종양 성장과 변화를 관찰했습니다. 종양 성장을 평가한 결과 KYSE-30 세포주에서(그림 6a-e) miR-301 inhibitor 또는 oe-PTEN 주입 누드 마우스의 종양 부피와 무게가 감소했습니다; miR-301 inhibitor의 종양 성장 억제 역할이 si-PTEN에 의해 소멸되었습니다. Eca109 세포주에서(그림 6f-j) miR-301 mimic 또는 si-PTEN 주입 누드 마우스의 종양 부피와 무게가 증가했습니다; PTEN 과발현이 miR-301 mimic의 종양 성장에 대한 효과를 역전시켰습니다. 한편 누드 마우스의 이종이식종에서 CD34 발현을 면역조직화학 염색으로 평가한 결과(그림 7a-d) KYSE-30 이종이식종에서 miR-301 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절 후 MVD가 억제되었습니다; PTEN 침묵이 miR-301 억제의 MVD에 대한 영향을 역전시켰습니다. Eca109 이종이식종에서 miR-301 상향 조절 또는 PTEN 하향 조절 후 MVD가 증가했습니다; miR-301 상향에 의해 유도된 MVD 증가가 PTEN 과발현에 의해 소멸될 수 있었습니다. 이 데이터들은 miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC에서 종양 성장과 혈관신생을 억제하며, miR-301 상향 또는 PTEN 침묵은 반대 효과를 가짐을 나타냅니다.

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 종양 성장 억제; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 종양 성장 증가. a KYSE-30 세포 형질주입 후 누드 마우스 피하 종양 형성으로 관찰된 종양 성장 대표 사진; b-d KYSE-30 세포 형질주입 후 각 그룹 종양 부피 변화; e KYSE-30 세포 형질주입 후 각 그룹 종양 무게 변화; f Eca109 세포 형질주입 후 누드 마우스 피하 종양 형성으로 관찰된 종양 성장 대표 사진; g-i Eca109 세포 형질주입 후 각 그룹 종양 부피 변화; j Eca109 세포 형질주입 후 각 그룹 종양 무게 변화. *P < 0.05 vs. inhibitor-NC 그룹; & P < 0.05 vs. oe-NC 그룹; ^#P < 0.05 vs. miR-301 inhibitors + si-NC 그룹; a P < 0.05 vs. mimic-NC 그룹; b P < 0.05 vs. si-NC 그룹; c P < 0.05 vs. miR-301 mimic + oe-NC 그룹, n = 3 마우스. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 다중 그룹 비교에 ANOVA 사용

miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 혈관신생 억제; miR-301 상향 또는 PTEN 감소가 ESCC 혈관신생 증가. a KYSE-30 세포 형질주입 후 누드 마우스 이종이식종 종양 조직의 면역조직화학 염색 대표 이미지; b 그룹 간 KYSE-30 종양 조직 MVD 비교; c Eca109 세포 형질주입 후 누드 마우스 이종이식종 종양 조직의 면역조직화학 염색 대표 이미지; d 그룹 간 Eca109 종양 조직 MVD 비교. *P < 0.05 vs. inhibitor-NC 그룹; & P < 0.05 vs. oe-NC 그룹; ^#P < 0.05 vs. miR-301 inhibitors + si-NC 그룹; a P < 0.05 vs. mimic-NC 그룹; b P < 0.05 vs. si-NC 그룹; c P < 0.05 vs. miR-301 mimic + oe-NC 그룹, n = 3 마우스. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현, 다중 그룹 비교에 ANOVA 사용

논의

EC는 위장관의 침습성 악성 종양의 일종입니다[16]. EC의 주요 유형으로서 ESCC는 식도 상피 세포에서 발생하는 악성 종양입니다[17]. 작은 비암호화 RNA로 알려진 miRNA는 RNA 침묵에서 주요 분자로서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다[18]. 본 연구는 miR-301과 그 표적 유전자 PTEN이 ESCC 진행에 미치는 영향을 탐구하기 위해 설계되었으며, miR-301 억제가 PTEN 상향 조절을 통해 ESCC에서 혈관신생과 세포 성장을 억제할 수 있음을 발견했습니다.

miR-301 발현을 평가한 결과, miR-301이 HEEC 대비 ESCC 세포에서 고발현됨을 확인했습니다. 또한 miR-301의 높은 발현이 인접 정상 조직 대비 ESCC 조직에서도 발견되었습니다. 이 결과와 유사하게 Li 등은 miR-301이 심근경색 조직에서 고발현됨을 확인했습니다[19]. 또한 PTEN이 miR-301에 의해 표적화됨을 규명했으며, 이 표적 관계는 기존 문헌에서도 지적되었습니다[20]. 또한 miR-301에 의해 표적화된 PTEN이 ESCC 조직과 세포 모두에서 하향 조절됨을 발견했습니다. 유사하게 선행 연구에서 PTEN이 비종양 식도 상피 조직 대비 ESCC에서 저발현됨이 밝혀졌습니다[21]. 게다가 Ma 등은 PTEN 발현이 Eca109 세포주에서 저하됨을 밝혔습니다[22], 이 세포주도 본 연구에서 일련의 실험에 선정되었습니다. 이들 연구는 ESCC에서 miR-301 고발현과 PTEN 저발현에 대한 증거를 제공합니다.

본 연구의 또 다른 중요한 결과는 miR-301 억제가 PTEN 발현 향상을 통해 ESCC 세포의 집락 형성 능력과 세포 증식을 억제할 수 있으며, miR-301 상향 또는 PTEN 감소는 반대 효과를 가짐을 보였습니다. 유사하게 Han 등은 루테올린에 의해 매개된 miR-301 하향 조절이 전립선암에서 세포 증식을 억제할 수 있음을 규명했습니다[6]. 최근 문헌에서 PTEN 과발현이 췌장암 세포 증식을 억제함이 밝혀졌습니다[23], 전립선암 연구에서도 같은 결과가 요약되었습니다[24]. 또한 miR-301 하향 조절 또는 PTEN 상향 조절이 ESCC 세포 이동과 침윤을 억제할 수 있으며, miR-301 상향 또는 PTEN 감소는 반대 경향을 보임을 발견했습니다. 이 결과와 일치하게 Shi 등은 miR-301 억제가 유방암 세포 이동과 침윤을 약화시킴을 뒷받침했습니다[10], miR-130b 억제와 PTEN 상향 조절로 ESCC 세포 이동과 침윤을 억제할 수 있음이 보고되었습니다[25]. 이들 발표는 다양한 인간 암에서 miR-301의 온코진 역할과 PTEN의 종양 억제 효과를 검증하는 데 도움을 주었습니다. 본 연구의 또 다른 결과는 miR-301 억제 또는 PTEN 과발현이 ESCC 세포에서 세포자멸사를 촉진하고 G0/G1기에서 세포 주기 정지를 유도하며, miR-301 상향 또는 PTEN 감소는 역효과를 가짐을 보였습니다. 유사하게 최근 문헌에서 활성화된 PTEN이 ESCC에서 세포 주기 정지와 세포자멸사를 유도함이 밝혀졌습니다[26]. 일관되게 Tian 등은 PTEN 상향 조절이 혈관내피세포 성장 인자 발현 감소를 통해 간세포암에서 혈관신생을 억제함을 발견했습니다[27]. 위 데이터들을 바탕으로 miR-301과 PTEN이 다양한 질환에서 세포자멸사와 혈관신생에 미치는 역할이 추가로 확인되었습니다. 결과적으로 miR-301 하향 조절이 PTEN 고발현을 통해 ESCC에서 종양 성장을 억제할 수 있음을 결론지었으며, 유사한 결론이 유방암[10]과 전립선암[28]에서도 밝혀졌습니다. 반대로 miR-301 상향 또는 PTEN 감소는 ESCC에서 종양 성장을 유도했습니다. miR-301과 PTEN이 체내 암세포 성장에 관여함을 결론지을 수 있습니다.

결론

본 연구에서 miR-301 억제가 PTEN 상향 조절을 통해 ESCC 세포에서 혈관신생, 세포 증식, 이동, 침윤을 억제하고 세포자멸사를 촉진함을 보였습니다. 이 연구는 ESCC의 잠재적 분자 메커니즘 이해를 증진시키고 ESCC 치료를 위한 새로운 표적을 제공할 수 있을 것입니다.

약어

ESCC:

식도 편평상피암 (Esophageal squamous cell carcinoma)

PTEN:

인산화효소 및 텐신 동종체 (Phosphatase and tensin homologue)

MVD:

미세혈관 밀도 (Microvessel density)

EC:

식도암 (Esophageal cancer)

miRNAs:

마이크로RNA (MicroRNAs)

LNM:

림프절 전이 (Lymph node metastasis)

UICC:

국제암대책연합 (Union for International Cancer Control)

RT-qPCR:

역전사 정량적 중합효소 연쇄반응 (Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)

3′UTR:

3'-비번역 영역 (3'-Untranslated region)

WT:

야생형 (Wild type)

MUT:

돌연변이형 (Mutant type)

HRP:

과산화효소 (Horseradish peroxidase)

FBS:

태아 소 혈청 (Fetal bovine serum)

OE:

과발현 (Overexpressed)

NC:

음성 대조 (Negative control)

CCK-8:

세포 계수 키트 (Cell counting kit)

DMEM:

둘베코 변성 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium)

PI:

요오드화 프로피듐 (Propidium iodide)

FITC:

플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate)

MVD:

미세혈관 밀도 (Microvessel density)

ANOVA:

분산 분석 (Analysis of variance)