고형 종양의 부정확한 위치 파악과 내재적 방사선 저항은 방사선 요법의 임상적 시행을 심각하게 방해했습니다. 이 연구에서 우리는 히알루론산 기능화된 가돌리늄 산화물 나노입자(HA-Gd2 O3 NPs) 효과적인 자기 공명(MR) 영상화 및 종양의 방사선 감작을 위한 원 포트 열수 공정을 통해. HA 기능화로 인해 준비된 HA-Gd2 O3 직경이 105 nm인 나노입자는 물에 대한 양호한 분산성, 낮은 세포독성 및 우수한 생체적합성을 보였고 HA 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 암세포의 세포질로 쉽게 진입하였다. 중요한 것은 HA-Gd2 O3 NP는 높은 경도 이완성을 나타냈다(r 1 ) 6.0 mM −1 S −1 MRI 조영제 및 복용량 의존적 방식의 방사선 과민화 향상. 이러한 발견은 합성된 HA-Gd2가 O3 이중 기능의 치료학적 제제로서의 NP는 종양 진단 및 방사선 요법에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
방사선 요법은 고에너지 X선과 자유 라디칼 손상 또는 DNA 손상을 유발하여 종양 부위에 방사선량의 침착을 포함하는 암에 광범위하게 적용되었습니다[1,2,3,4]. 그러나 열악한 방사선 민감도, 종양 위치의 부정확성, 병변 간 식별 불량, 방사선 조사 부작용을 유발하는 정상 조직으로 인해 방사선 치료의 임상적 시행이 제한된다[5]. 따라서, 전신 부작용을 최소화하면서 종양 방사선 감수성을 향상시키는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 나노기술과 방사선 요법의 조합은 방사선 감작에 대해 잘 확립된 우선 순위입니다.
최근 몇 년 동안 나노기술은 암 진단 및 치료를 위한 매력적인 전략으로 간주되었습니다[6,7,8,9,10,11]. 나노입자(NPs)의 주요 기능 중 하나는 수동 표적화, EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과, 능동 표적화 및 연장된 순환 시간을 통해 종양 조직에 나노입자의 선택적 축적을 기반으로 한 정확한 종양 표적화이다[12, 13,14]. 우리의 이전 연구는 헤테로원자로 탄소 NP를 도핑하는 것이 본질적인 특성을 효과적으로 조정하고 유익한 기능을 도입한다는 것을 보여주었습니다[15,16,17]. 흥미롭게도 NP는 방사선 감작제로 사용될 수 있습니다[18]. 유망한 방사선 과민제로 중금속(높은 Z 요소 포함) NP(예:Au, Bi, Gd)는 높은 X선 광자 포획 단면과 Compton 산란 효과 때문에 방사선 과민 치료에 사용할 수 있습니다[19]. X선이 높은 Z 나노입자, 오제 전자, 광전자와 상호작용할 때 2차 전자의 방출은 암세포를 손상시켜 방사선 치료 중 선량을 증가시킨다[20]. 현재까지 가돌리늄 기반 나노입자(GdNPs)는 효과적인 MRI 조영제(CA)[21, 22]로 알려져 있으며 정상 조직을 질병 조직 및 병변과 비침습적 방식으로 실시간으로 구별합니다. 이러한 제제는 종방향 이완 시간을 단축시켜 종방향 이완성 r에 영향을 미칩니다. 1 [23], 그들의 부정확한 표적화는 종종 부작용을 초래한다. 히알루론산(HA)은 클러스터 결정자 44(CD44)와 같은 HA 수용체가 있는 표적 부위에 대한 주요 리간드이자 약물 전달 운반체라는 것은 잘 알려져 있습니다[24,25,26].
이전 연구의 결과에 따라 Gd2를 기능화하기 위한 표적 리간드로 HA를 사용했습니다. O3 이중 기능을 가진 NP:고유한 방사선 저항 및 종양 위치 파악의 부정확성을 극복하기 위한 효과적인 종양 표적 MRI CA 및 방사선 과민제. 또한 HA-Gd2 O3 NP는 높은 종방향 이완성을 나타냅니다(r 1 ) 더 나은 MR 영상 품질을 가진 유망한 MR 영상 에이전트로. 현재 사용 가능한 CA[27, 28]와 비교하여 결과적으로 HA-Gd2 O3 NP는 세 가지 중요한 이점을 보여줍니다. 첫째, HA-Gd2 O3 NP는 전구체로 천연 세포외 기질을 사용하기 때문에 유리한 생체 적합성을 나타냅니다. 둘째, HA 기능화는 종양 표적화를 크게 개선하고 부작용을 줄입니다. 마지막으로 HA-Gd2 O3 NP는 진단 및 치료에서 이중 기능을 가지고 있습니다. 방사선 과민증의 효과를 확인하고 메커니즘을 탐색하기 위해 HA-Gd2의 방사선 과민 효과를 평가했습니다. O3 종양 세포 생존, 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 NP.
이 연구에서 HA-Gd2 O3 NP는 Scheme 1과 같이 간단한 열수 공정을 사용하여 성공적으로 제조되었습니다. 입자 크기는 동적 광산란으로 분석하고 형태학적 검사는 투과 전자 현미경으로 수행했습니다. 도 1a에 도시된 바와 같이, HA-Gd2 O3 NP는 명백한 응집 없이 균일한 분산과 이산적인 준구형 모양을 나타냈다. HA-Gd2의 평균 직경 O3 NP는 105 nm였다. 정상 조직과 비교하여 종양 조직의 모세혈관 내피 투과성은 증가하였고 내피 간극은 100-600 nm였다[29]. 따라서 원하는 크기의 나노입자는 종양 조직에 쉽게 침지되어 수동 표적 약물 전달의 효율성을 획기적으로 높일 수 있습니다.
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HA-Gd2의 개략적 합성 O3 열수 방법(A) 및 다음 생물의학 응용(B)에서 NPs
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HA-Gd2의 특성화 O3 NP. 낮음(a ) 및 높음(b ) 확대 TEM 이미지. 직경 분포(c ) 및 XRD 패턴(d ) HA-Gd2 O3 NP
HA-Gd2의 위상 구조 O3 NP는 대조군으로 산화흑연(GO) 전력을 사용하여 XRD로 조사했습니다. 도 1d에 도시된 바와 같이, 하나의 주요 회절 피크(2θ =12.04°) 및 두 개의 작은 피크(2θ =29.6°, 42.1°)가 HA-Gd2에서 관찰되었습니다. O3 GO(100 평면) 및 흑연(002 평면)의 특성 피크에 각각 해당하는 NP 회절 패턴. HA-Gd2의 주요 격자 간격 O3 NP는 d의 GO 간격보다 작은 간격(Bragg 공식에 의해 계산된 0.73 nm)을 보였습니다. 001 =0.85 nm, 여기서 피크 위치의 상향 이동은 sp 3 사이의 간격 감소에 기인할 수 있습니다. 레이어. 모든 넓은 회절 피크는 HA-Gd2 O3 NP는 무질서한 탄소 구조와 sp 2 의 감소에 기인한 무정형 구조를 가졌습니다. (C–C) 탄화 과정 중 층 간격. 결과는 HA-Gd2를 추가로 나타냅니다. O3 열악한 결정질 특성을 갖는 NP는 탄소 점에 관한 이전 보고서[30, 31]와 일치하는 이질적인 다층 구조를 보유했습니다.
HA-Gd2의 표면 작용기 및 조성 O3 NP는 푸리에 변환 적외선 스펙트럼과 X선 광전자 분광법을 사용하여 조사되었습니다. 그림 2a와 같이 XPS 스펙트럼은 284.0, 400.0, 530.6, 1188.5 eV에서 4개의 전형적인 피크를 보여 HA-Gd2 O3 NP는 주로 가돌리늄, 탄소, 산소 및 수소 원소로 구성되었습니다. Gd3d의 고해상도 스펙트럼 (그림 2b)는 1187.5 eV와 1221 eV에서 두 개의 강한 피크의 존재를 보여주었고, 이는 각각 3d에 해당하는 32 eV의 스핀-궤도 분할에 해당합니다. 5/2 그리고 3d 3/2 Gd의 에너지 준위. 이러한 관찰은 HA-Gd2의 이전 보고서와 잘 일치했습니다. O3 NP. O(1s ) 그림 2c에 표시된 스펙트럼은 O 2- 사이의 결합에 해당하는 531.4 eV에 위치한 하나의 주요 피크에 의해 지배되었습니다. 및 Gd 3+ . FITR 분광법은 육안 및 HA-Gd2 모두에 대해 수행되었습니다. O3 NP 샘플(그림 2d). Naked 샘플의 경우 그림 2a와 같이 v의 특성 흡수 밴드 으로 1580 및 1380 cm −1 에서 O–C–O 탄산염기의 존재를 밝혔다. 3340 및 2900 cm −1 의 넓은 피크 표면 흡착수에 해당하는 OH 및 CH 신축 진동에 각각 기인합니다. HA-Gd2용 O3 NP, COO의 스트레칭 진동 − 1580 및 1380 cm −1 에서 히알루론산의 카르복실기가 도입되었음을 나타냅니다. 이러한 결과는 HA-Gd2의 작용기가 O3 NP는 주로 특정 다수의 카보닐, 카복실레이트 및 하이드록실 그룹을 포함했습니다. 표면에 위치한 이러한 작용기의 존재는 HA-Gd2 부여 O3 물에 대한 분산성이 우수한 NP. 중요하게는, NP의 표면에 내장된 Gd 이온은 MR 이미징 및 방사선 감작에 유용할 수 있으며, 이는 Gd 이온이 주변 환경으로 누출되는 것을 극적으로 방지합니다.
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HA-Gd2의 화학 구조 및 조성 O3 NP. 아 HA-Gd2의 전체 스캔 XPS 스펙트럼 O3 NP. ㄴ Gd3d 스펙트럼. ㄷ O1S 스펙트럼. d HA-Gd2의 FTIR 스펙트럼 O3 NP
HA-Gd2의 생체적합성 O3 잠재적인 생물의학 제제로서 NP는 생물의학 응용에 매우 중요합니다. 첫째, HA-Gd2의 고유한 세포독성 O3 NP는 CCK-8 분석을 사용하여 HepG2 및 VSMC 세포에서 평가되었습니다. 도 3a 및 S. Fig. 1에 도시된 바와 같이, HA-Gd2 O3 NP는 3 일까지 명백한 세포독성을 나타내지 않았다. 24시간 노출 후 200μg/mL의 농도에서도 세포 생존율은 약 90%였습니다. 둘째, HA-Gd2의 혈액적합성 O3 생체 내 NP는 용혈 분석을 사용하여 추정되었습니다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 우리는 물에서 적혈구의 용혈을 관찰하였다(양성 대조군). 대조적으로, HA-Gd2 후에 명백한 용혈은 관찰되지 않았습니다. O3 PBS 용액(음성 대조군)의 결과와 유사한 2 시간 동안 0에서 200 μg/mL의 다양한 농도에서 NP 인큐베이션. 음성 대조군과 비교하여 다양한 농도의 HA-Gd2에서 용혈률 O3 NP는 541 nm에서 상층액의 흡광도를 기반으로 약간 평가되었습니다. 결과는 HA-Gd2의 용혈 비율이 O3 NP는 연구 농도에서 모두 3% 미만이었고 유리한 혈액 적합성을 확인했습니다. 잠재적인 독성을 조사하기 위해 HA-Gd2 O3 NP는 Balb/c 마우스에 정맥 주사되었습니다(S. 그림 2 참조). 1주일 후, 이 마우스를 처형하고, 병리학적 단면 분석을 위해 방광, 신장 및 비장을 수확하였다. S. Fig. 2에서 보는 바와 같이, HA-Gd2의 장기에서 관찰할 수 있는 병변이나 염증반응은 관찰되지 않았다. O3 NP 처리된 마우스. 이러한 결과는 합성된 HA-Gd2가 O3 NP는 유리한 세포적합성과 양호한 혈액적합성을 가졌다.
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아 HA-Gd2의 효과 O3 CCK-8 분석을 사용한 HepG2 및 VSMC 세포의 생존율에 대한 NP. ㄴ HA-Gd2의 용혈 활동 O3 다양한 농도의 NP(50, 100, 200, 300 및 400 μg/mL). PBS 및 물은 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었습니다.
세로(T 1 ) HA-Gd2의 이완 시간 O3 NP는 인산염 완충 식염수(pH =7.4, 0.2 M)를 사용하여 대조군으로 상용 조영제 Magnevist(Gd-DTPA)와 함께 시험관 내에서 조사되었습니다. Gd 농도가 증가함에 따라 T의 신호 강도 1 - 가중치 팬텀 이미지가 명확하게 증가하여 모든 샘플이 T에서 MRI 대비 향상을 생성할 수 있음을 나타냅니다. 1 -가중 시퀀스(그림 4a). 또한 신호 강도 대 반전 시간의 플롯은 T를 제공했습니다. 1 -특정 농도에서 각 조영제의 이완 시간. 도 4b에 도시된 바와 같이, r 1 HA-Gd2의 값 O3 NP는 6.0 mM −1 으로 측정되었습니다. S −1 , 이는 Magnevist(3.86 mM −1 )보다 훨씬 높았습니다. S −1 ) 같은 조건에서. 향상된 r 1 HA-Gd2의 훨씬 더 높은 유체역학적 반경과 표면적 때문일 수 있습니다. O3 NP; 따라서 NP의 격자에 도핑된 더 많은 Gd 원자가 물 분자에 접근할 수 있게 되어 세로 이완이 단축되고 r 1 가치.
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아 T1 HA-Gd2의 팬텀 이미지 O3 총 Gd 이온 농도가 다른 NP. ㄴ 1/T1의 해당 플롯 총 Gd 이온 농도에 대해. ㄷ 생체 내 T1 HA-Gd2 정맥 주사 후 마우스의 MR 영상 및 분석 O3 조영제로서의 NP. d 투여 후 다른 시점에서 방광과 신장의 신호 변화(SNR 비) 정량화(n =3). *p <0.05
생체 내 잠재적인 응용 프로그램을 결정하기 위해 HA-Gd2의 MR 영상 성능 및 순환 운명 O3 NP(10 mg/kg)는 정상 BALB/c 마우스를 모델로 한 MRI 스캐너를 사용하여 조사되었습니다. 주입 전 이미지(그림 4c)와 비교하여 점선 원으로 표시된 신장 및 방광의 밝은 영역이 주입 후 10분에서 명확하게 관찰되었으며, 이는 HA-Gd2 O3 NP는 CA가 T를 향상시키는 데 사용될 수 있습니다. 1 생체 내에서 이러한 주요 기관의 이완. 중요한 것은 HA-Gd2의 대비 향상 O3 NP는 주사 후 60분까지 유지되었으며, 이는 Gd 복합 소분자보다 훨씬 더 길었으며(소동물에서 반감기는 약 몇 분)[27], 이는 HA-Gd2 O3 NP는 상업적 대조보다 생체 내에서 더 긴 체류 시간을 보유했습니다. MR 대비 효과를 정량적으로 분석하기 위해 MRI 영상의 관심 영역을 미세하게 분석하여 신호 대 잡음비(SNR)를 계산하고 SNRpost 값을 계산했습니다. /SNR사전 RSE(상대 신호 향상)를 나타냅니다(그림 4d). HA-Gd2의 RSE 값 O3 신장의 NP는 1.35, 1.99 및 1.86이었습니다. 유사하게, HA-Gd2의 RSE 값 O3 방광의 NP는 신장의 NP보다 높았다(1.29, 3.59, 2.26). HA-Gd2 O3 큰 크기(100 nm 이상)의 나노입자는 긴 순환 시간을 나타내었고 이전 결과에 따라 담도-장 경로로 제거될 수 있습니다[32]. 또한, 생체 내 순환 시간이 길어지면 EPR 효과를 향상시켜 종양에서 수동 표적화를 증가시킬 수 있습니다.
HA-Gd2 O3 MR 영상 성능이 우수하고 순환 시간이 긴 나노입자는 EPR 효과를 통해 종양을 영상화할 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 따라서 우리는 간세포 암종(HCC)이 HA-Gd2에 의해 검출될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 피하 간 종양 모델을 확립했습니다. O3 NP 강화 MRI. HA-Gd2 정맥 주사 후 O3 NP, 우리는 관상 및 횡 스캔 모두에서 볼 수 있듯이 피하 종양 영역이 주변 조직보다 밝아지는 것을 관찰했습니다(그림 5a). 피하 종양의 RES는 가로 및 관상 스캔에서 각각 1.54 및 1.83에 극적으로 도달하여 HA-Gd2의 효과적인 축적을 나타냅니다. O3 EPR 효과를 통한 종양 부위의 NP 이러한 발견은 HA-Gd2가 O3 NP는 종양의 MRI 시각화에 매우 민감합니다. 많은 연구에서 긴 순환 시간이 고형 종양의 누출된 혈관 구조를 통한 수동적 표적화의 효율성을 촉진할 수 있음을 보여주었습니다[33].
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티 1 -가중 MR 영상(a ) 및 해당 정량 분석(b ) HA-Gd2 정맥 주사 후 Heps 마우스 간암 이종이식 종양 O3 NP
HA-Gd2의 우수한 성능 O3 T로서의 NP 1 조영제는 종양의 방사선 감작에서 그 위치를 정확하게 결정하도록 촉구했습니다. 먼저, CCK-8 분석을 사용하여 이 병용 치료로 용량 증가가 발생했는지 여부를 조사했습니다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 단일 HA-Gd2 O3 나노입자(농도 0–200 μg/mL)는 HepG-2의 생존율에 유의한 영향을 미치지 않았지만 X선(범위 0–9Gy) 조사는 9Gy에서 HepG-2 세포 생존율을 70% 미만으로 감소시켰습니다. 중요한 것은 X선 조사와 HA-Gd2의 조합입니다. O3 NP는 특히 9Gy에서 200 μg/mL 농도에서 HepG-2 세포 생존율을 50% 미만으로 극적으로 감소시켰습니다. 다음으로, X-선 조사와 HA-Gd2를 조합한 후 HepG-2 세포에서 세포 생존력을 평가하기 위해 클론 생성 분석을 수행했습니다. O3 NP. 그림 6b와 같이 단일 HA-Gd2 O3 나노입자는 HepG-2 세포 집락 형성에 극적인 영향을 미치지 않았지만, X선 조사는 HepG-2 세포 집락 형성을 46.7%로 감소시켰다. 그러나 X선 조사와 HA-Gd2 O3 NP는 29.8%까지 세포 콜로니 형성 생존력을 현저하게 억제했습니다. 해당 이미지는 HA-Gd2의 방사선 과민성을 추가로 확인했습니다. O3 HepG-2 세포에 대한 NP.
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HA-Gd2의 방사선 감작 효과 O3 시험관 내 NP. 아 HA-Gd2의 시너지 효과 O3 나노입자(0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 및 200 μg/mL) 및 X선 방사선(0 Gy, 3 Gy, 6 Gy 및 9 Gy) CCK-8 분석을 사용한 HepG2 세포의 생존력. *p <0.05, **p <0.01, 차이는 통계적으로 유의했습니다. ㄴ HA-Gd2로 처리된 HepG2 세포의 콜로니 생존 분석 O3 NP 및 X선 방사선 및 c 클론 생성 능력의 해당 정량 분석. d 상이한 처리 후 상이한 마우스 그룹의 종양 부피 성장 곡선. 그룹:a 제어, b 방사선, c HA-Gd2 O3 NP 및 d 방사선 + HA-Gd2 O3 NP. 이 치료 종료 시 여러 그룹의 마우스에서 수집한 종양 사진
체외 방사선 요법의 효과는 HA-Gd2를 적용하도록 권장했습니다. O3 종양 보유 마우스에서 종양 성장을 제어하기 위해 방사선 조사와 결합된 NP. 대조군 및 단일 HA-Gd2의 종양 부피 O3 NP 처리는 빠르게 성장했고 둘 다 180% 증가했습니다. 단일 조사 처리에 비해 58%, HA-Gd2 O3 방사선과 결합된 NP는 방사선 조사 10 후 38%의 효율적인 종양 억제를 나타냈다(그림 6d). 종양을 촬영하였고, 각 그룹의 평균 종양 부피는 그룹 (a)의 평균 종양 부피가 가장 높았고 그룹 (d)의 평균 종양 부피는 모든 그룹 중 가장 낮은 것을 보여 주었다 (그림 6e). 이 결과는 준비된 HA-Gd2 O3 NP는 X선 조사에서 종양 성장 억제에 유망합니다.
HA-Gd2 복합 치료에서 방사선 감작 메커니즘을 더 이해하기 위해 유세포 분석 및 살아있는/죽은 염색 분석을 수행했습니다. O3 NP와 X선 방사선. 도 7a에 나타난 바와 같이, 단일 HA-Gd2를 처리한 HepG-2 세포에서 적색이 없는 강한 녹색 형광이 관찰되었다. O3 높은 세포 생존력을 확인하는 NP. X선 조사 후 소량의 적색 형광이 관찰되었으며 이는 낮은 수준의 세포 사멸을 나타냅니다. 그러나 HA-Gd2의 조합 처리 후 강한 적색 형광이 관찰되었습니다. O3 NP(200 μg/mL) 및 방사선, HA-Gd2 O3 NP는 X선 조사로 인한 세포 사멸을 극적으로 향상시킬 수 있습니다. HA-Gd2의 방사선감작 메커니즘 O3 NP는 유세포 분석을 사용하여 추가로 조사되었습니다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 단일 방사선 및 HA-Gd2 O3 NP는 G2/M 위상 정지의 각각 27.55% 및 19.12%를 유도했습니다. 그러나 HA-Gd2의 병용 치료 O3 NP와 방사선은 G2/M 위상 정지를 용량 의존적으로 30.89%에서 33.27%까지 증가시켰습니다. 한편, 복합 치료는 단일 HA-Gd2일 때 sub-G1 비율에 의해 반영된 바와 같이 10.63%에서 22.67%로 세포 사멸을 유도했습니다. O3 NP 및 방사선 유도 3.02% 및 13.87%. 세포 사멸의 가능한 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 Annexin V-EGFP/PI 방법을 유세포 분석법으로 수행했습니다. Annexin V-EGFP 방출 신호는 x -축, PI 방출 신호가 y에 플롯되는 동안 -축(그림 8). 괴사 세포, 조기 세포 사멸 세포, 후기 세포 사멸 세포 및 살아있는 세포의 양은 Annexin V - 의 백분율로 결정되었습니다. /PI + (Q3), Annexin V + /PI + (Q2) 및 Annexin V − /PI − (Q4), 각각. 대조군 및 단일 HA-Gd2에서 세포의 세포자멸사 비율 O3 NP(100 μg/mL)군은 5% 미만으로 미묘하게 영향을 미쳤다. 단일 방사선 치료군(8.8%)과 비교하여 HA-Gd2 조합의 세포 사멸률 O3 NP와 방사선은 농도가 50에서 200 μg/mL로 증가함에 따라 증가했습니다. 특히 200 μg/mL 농도일 때 세포의 조기 세포사멸 비율은 33.2%로 분명히 증가하였고 조기 및 후기 세포사멸은 44.3%에 도달하였다. 일반적으로 HA-Gd2의 조합 O3 나노입자와 X선 조사는 세포 콜로니 형성, 용량 의존적 세포 생존율 및 방사선 감작성 증진 효과에 상승 효과가 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 HA-Gd2 O3 NP는 방사선 요법에 대한 방사선 과민성을 향상시키는 효율적인 대안이 될 수 있습니다.
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HA-Gd2의 방사선량 향상 O3 NP. 아 HepG2 세포의 생사 염색. 녹색(fluorescein diacetate 염색) =살아있는 세포, 빨간색(propidium iodide 염색) =죽은 세포. 스케일 바 =200 mm. ㄴ 다양한 처리 후 세포 주기 분포는 유세포 분석법을 사용하여 DNA 함량을 정량화하여 분석했습니다.
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HA-Gd2의 세포자멸사 분석 O3 NP. 아 X선 방사선 처리 후 24 h에서의 HepG-2 세포의 세포자멸사 수준. b 해당 정량 분석
결론적으로 우리는 이중 기능 HA-Gd2를 개발했습니다. O3 원 포트 열수 과정에서 종양의 효과적인 MR 이미징 및 방사선 감작을 위한 NP. HA로 코팅한 후 합성된 HA-Gd2 O3 NP는 물에서 유리한 분산성과 우수한 생체적합성을 나타냈다. 결과 HA-Gd2 O3 Gd 원자를 캡슐화하는 NP는 높은 종방향 이완성을 효과적으로 나타낼 뿐만 아니라(r 1 ) MRI의 경우 T 1 조영제 뿐만 아니라 방사선 감작제로서 세포 사멸을 유도하고 세포 주기를 차단하여 종양의 방사선 감수성을 향상시킵니다. 따라서 새로운 HA-Gd2 O3 NP는 종양 진단 및 방사선 요법에 대한 유망한 잠재력을 보여줍니다.
Fluorescein diacetate(FDA)와 propidium iodide(PI)는 Sigma(New York, NY, USA)에서 구입했습니다. GdCl3 ·6H2 O, 에틸렌 글리콜(99%)은 Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.(Lianyungang, Jiangsu, Chinese People's Republic of China)에서 구입했습니다. Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 Dojindo(Kumamoto, Japan)에서 구입했습니다. NaH2 PO4 , 나2 HPO4 , 및 H2 SO4 Guangfu Fine Chemical Research Institute(중화인민공화국 톈진 난카이)에서 입수했습니다. 태아 소 혈청 및 Dulbecco의 최소 필수 배지(DMEM)는 Invitrogen China Limited(중화인민공화국 상하이)에서 구입했습니다. 모든 화학 물질은 분석 등급이었고 추가 정제 없이 사용되었습니다.
HA-Gd2 O3 NP는 다음과 같이 원 포트 열수 접근법을 사용하여 제조되었습니다. 먼저 0.1g의 HA를 주위 온도에서 밤새 격렬하게 교반하면서 20mL의 물에 용해했습니다. 이어서, 0.1 g의 GdCl3 ·6H2 O 및 0.5 mL의 NaOH(1 M)를 각각 첨가하였다. 그런 다음 혼합물을 5분 동안 더 교반하여 균질한 투명한 용액을 형성하고 50mL 오토클레이브에 옮기고 밀봉하고 120℃에서 6시간 동안 열수 처리하였다. 실온으로 자연 냉각시킨 후 투명한 현탁액을 0.22μm 멤브레인으로 여과하여 큰 덩어리를 제거하였다. 그런 다음 준비된 용액을 14-kDa 분자량 컷오프가 있는 투석 백에서 3 일 동안 물에 대해 투석했습니다. 투석액을 채취하여 진공동결건조기를 이용하여 동결건조하였다. HA-Gd2 O3 따라서 NP 분말을 얻고 추가 특성화를 위해 저장했습니다.
HA-Gd2의 형태 O3 NP는 200 kV의 가속 전압에서 JEM-2100 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)에서 고해상도 투과 전자 현미경으로 검사되었습니다. HA-Gd2의 원소 구성 O3 NP는 X선 소스로 Al-Ka(1486.6 eV)와 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광계(Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, USA)를 사용하여 MK II 광전자 분광계에서 XPS 측정에 의해 결정되었습니다. HA-Gd2의 결정 구조 O3 NP는 Cu Kα(λ =0.15405 nm) 5 ~ 80° 범위에서 4°/분의 스캔 속도에서 방사선.
HA-Gd2의 영향 O3 세포 생존율에 대한 NP는 Cell Counting Kit CCK-8 분석(CCK-8 분석)을 통해 연구되었습니다. HepG2(인간 간암, ATCC 번호:HB-8065) 및 VSMC(혈관 평활근 세포)를 96웰 플레이트에 3 × 10 3 밀도로 시딩했습니다. 세포/웰 및 37 °C, 5% CO2에서 배양 다른 농도의 HA-Gd2를 함유한 DMEM을 사용하여 24시간 동안 배양 O3 성장 배지를 대체하는 NP(0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 및 200 μg/mL). 4 시간 더 배양한 후, 각 웰에 10μL CCK-8 용액을 첨가하고, 세포를 어두운 곳에서 4시간 동안 배양하였다. 흡광도는 Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader(Bio Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 490 nm에서 측정되었습니다. 처리되지 않은 세포(DMEM에서)는 대조군으로 사용되었으며 상대적인 세포 생존율(평균 SD, n =5) Abssample/Abscontrol × 100%로 표현하였다.
간단히 말해서, 19-21 g, 6주령 암컷 BALB/c 생쥐는 중국 보건부의 동물 관리 규칙에 따라 친절하게 준비되었습니다. 헤파린 나트륨으로 안정화된 3밀리리터의 혈액은 안구를 제거하여 얻어졌습니다. 그런 다음 문헌에 따라 1200 rpm, 15 min으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그 후 침전물을 PBS로 5회 세척하여 마우스 적혈구(MRBCs)를 얻은 후 안구를 제거하여 혈액 약 3mL를 취하여 헤파린나트륨으로 안정화한 후 원심분리(1, 200 rpm, 15 min) 문헌[27]에 따라 상층액을 제거하기 위해 PBS로 5회 세척하여 마우스 적혈구(MRBC)를 얻었다. PBS로 10배 희석하여 0.1 mL MRBC를 HA-Gd2의 다양한 입자 농도(50–200 μg/mL)를 포함하는 0.9 mL PBS로 미리 채워진 1.5mL 튜브로 옮겼습니다. O3 NP, 각각 0.9 mL 물(양성 대조군) 및 0.9 mL PBS(음성 대조군). 혼합물을 부드럽게 흔든 후 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 12,000rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 마지막으로 모든 시료의 사진을 찍고 상층액(헤모글로빈)의 흡광도를 UV-2450 UV-Vis 분광광도계로 측정하였다. 541 nm에서 시료, 양성대조군, 음성대조군 간의 흡광도 차이를 나누어 서로 다른 시료의 용혈률을 계산했습니다.
In vitro and in vivo MR images were acquired on 3 Tesla MRI scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Germany). To study the T 1 phantom images in vitro, the solution of HA-Gd2 O3 NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4). Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd2 O3 NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.
CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd2 O3 NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10 3 cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO2 incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd2 O3 NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.
Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10 4 cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd2 O3 NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.
To study the radiosensitization effect of HA-Gd2 O3 NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10 4 cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd2 O3 NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd2 O3 NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.
Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10 6 HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm 3 , subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.
Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd2 O3 NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b 2 , where V (mm 3 ) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0.05, **p <0.001).
The data sets supporting the results of this article are included within the article.
나노물질
초록 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 산업, 상업 제품 및 의약 분야를 포함한 광범위한 응용 분야에서 사용됩니다. ZnO NP의 독성에 대한 수많은 기계론적 연구가 깨끗한(신선한) NP에 대해 수행되었습니다. 그러나 변형된(노화) ZnO 나노입자에 의해 유도된 세포독성과 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 여기에서 우리는 시간이 지남에 따라 ZnO NP의 물리화학적 변형을 관찰한 후 신선하고 오래된 NP의 세포 독성을 평가했습니다. 우리는 신선한 ZnO 나노입자가 노화된 나노입자보다 더 높은 세포자멸사 수준을 유도한다는
초록 온열요법은 비침습성, 부작용 및 독성 최소화, 시행 용이성으로 인해 암 질환을 치료하는 가장 환자 친화적인 방법 중 하나이며 광열 유발 용량 시스템과 같은 새로운 치료 방법의 개발을 촉진합니다. 여기에서 이 연구는 Cs0.33의 광열 효과 변수를 조사합니다. WO3 시험관 내에서 HepG2 간암 세포주에 대한 나노입자(NP), 조사 기간, 광학 전력 밀도 및 NP 농도는 근적외선(NIR) 조사 열 용량의 공식화로 이어집니다. 명시적으로, 120nm의 입자 형상 크기를 갖는 NP는 일련의 산화-환원(REDOX) 반응, 열 어닐
