저준위 레이저 요법(LLLT)은 종양 조직/세포를 표적으로 하는 광선 요법의 안전한 유형으로 알려져 있습니다. 또한 표적 나노입자를 사용하면 암 치료의 성공률이 높아집니다. 이 연구는 엽산(FA)/메토트렉세이트(MTX)가 함유된 실리카 코팅 금(Au@SiO2 ) 나노 입자(NP) 및 유방암과의 싸움에 대한 LLLT.
FTIR, TEM 및 DLS-Zeta를 사용하여 NP를 합성하고 특성화했습니다. NP는 평균 직경이 약 25 nm이고 양전하(+13.3 mV)인 구형 형태를 가졌지만 FA 및 MTX와 결합한 후 순 전하는 약 -19.7 mV로 감소했습니다.
세포 흡수 연구에서 우리의 발견은 엽산 수용체의 높은 발현으로 인해 특히 MDA-MB-231에서 두 유방암 세포주에서 FA 및 MTX가 NP를 로드한 후 NP의 향상된 세포 흡수를 분명히 보여주었습니다. 결과는 LLLT가 두 유방암 세포주 모두에 증식 효과가 있었지만 조작된 유방암 표적 나노입자가 있는 경우 MTT 분석(p<0.05), DAPI 염색 및 세포주기 발견. 유방암 세포주에 대한 가장 높은 세포자멸사 효과는 MTX-FA가 로드된 Au@SiO2 조합에 노출된 세포에서 관찰되었습니다. NP 및 LLLT는 DAPI 염색 및 세포 주기(subG0/G1에서 세포 정지를 증가시킴)에 의해 입증되었습니다. 화학 요법과 LLLT를 함께 사용하면 부작용을 최소화하면서 유방암 치료의 가능성을 높일 수 있습니다.
가장 흔한 여성으로서 암에 영향을 미치는 유방암(BC)은 최근 전 세계적으로 170만 건의 새로운 사례가 보고되었습니다[1]. 복잡한 병인과 치료에 대한 열악한 반응으로 인해 보편적으로 여성의 암 관련 사망의 중심 원인으로 알려져 있습니다[2,3,4,5]. 2014년에 미국에서 약 40,000명의 여성이 BC로 사망할 것으로 예측되었습니다[2, 6, 7] "(www.cancer.org)". 전체 사망자 수는 522,000명으로 저개발 지역에서 약 800,000명이 암으로 인한 사망의 다섯 번째 원인이며 선진국에서는 거의 같은 빈도입니다[1]. 아시아 국가에서는 60~70세 사이에 빈번한 서구 국가와 비교하여 40~50세 성인에서 가장 초기의 연령이 높습니다[8]. BC의 주요 위험 인자는 여성의 성별, 가족력, 연령 및 30세 이상의 나이에 첫 출산, 조기 초경 이후 폐경, 무산과 같은 다양한 유전적 성향입니다[9].
암과의 싸움에서 주요 목표는 종양, 주로 전이를 제거하고 더 나아가 재발을 예방하기 위해 독성이 낮고 특이성이 높은 효과적인 치료 계획을 개발하는 것입니다. 그러나 현재 사용되는 수술, 화학요법, 방사선 요법과 같은 암 치료 방법은 다양한 부작용을 보여[10,11,12], 모두 이러한 목표를 달성하지 못하고 있습니다[13, 14]
지난 수십 년 동안 암 치료에서 큰 어려움을 겪었습니다[15, 16]. 현재 인기 있는 치료적 접근 중에서 온열 요법이 전향적 치료 방법으로 성장하고 있다[17]. 최근에는 잠재적으로 효과적이고 비침습적인 암 치료법으로 광열 요법(PTT)이 많은 주목을 받고 있다[18, 19]. 광흡수 나노구조를 기반으로 하는 PTT는 일반적인 방법과는 다른 방식이 되었다[20, 21]. 일반적인 PTT에서는 레이저 조사(700-1100 nm 범위의 근적외선(NIR) 빛) 하에서 충분한 고열(42°C)을 받아 종양을 파괴하기 위해 PTT 제제를 사용하는 것이 매우 정밀하고, 무시해도 될 정도로 침습적인 암 치료 방법[22,23,24,25,26,27,28].
많은 나노 입자가 조영제, 약물 전달 운반체 및 레이저, 전파 및 초음파와 같은 에너지 양식의 변환기로 치료 효과를 담당하는 열 현상으로 널리 연구되었습니다 [29,30,31,32,33 ,34,35,36,37,38,39].
금 나노 입자는 높은 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)과 생체 분자와의 쉬운 표면 접합으로 인해 지난 10년 동안 큰 관심을 받았습니다[40]. 그들은 생물학적 시스템에서 유해한 부작용 없이 NIR 영역에서 고성능 광열 변환 능력[41,42,43]을 밝혔습니다[44].
금 나노 입자는 유망한 광합성기로 인식되고 있지만 반복적인 근적외선 조사에 대한 열악한 광열 안정성으로 인해 금 나노 입자는 점차적으로 광열 변환 능력을 잃어 임상 실습에서 사용이 제한됩니다. 또한, 금 나노 입자는 약물 로딩 용량이 낮고 약물 방출 프로필이 조절되기 때문에 좋은 약물 운반체가 아닙니다[45, 46]. 대안적으로, 메조다공성 실리카 나노입자(MSN)는 약물 로딩 능력이 더 높고 분해로 인해 생성되는 독성 함량이 없기 때문에 적절한 약물, DNA 및 단백질 운반체로 알려져 있습니다. 또한 큰 표면적, 제어 가능한 크기, 고가용성 기공 부피 및 원하는 표면 기능이 수정에 적용됩니다[47].
화학요법제 및 암 표적 리간드에 접합된 나노입자는 비특이적 전달, 낮은 수용성 및 낮은 치료 지수와 같은 일상적인 화학요법의 단점을 억제할 수 있습니다[48, 49].
doxorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, fluorouracil 및 docetaxel과 같은 화학 요법 특성을 나타내는 약제는 단독으로 또는 주요 핵심 치료제로 조합하여 사용되거나 PTT와 같은 다른 치료제와 함께 사용됩니다. 대부분의 암 환자들은 모든 장기에 영향을 미치는 환자의 신체 내에서의 정확하지 않은 분포로 인해 화학 요법 약물의 부작용을 경험합니다. 이러한 약물은 혈액 세포, 내부 장기를 덮고 있는 점막 세포, 모낭과 같이 빠르게 성장하는 일부 정상 세포를 손상시킵니다[50,51,52,53].
메토트렉세이트(MTX)는 류마티스 관절염과 피부, 폐, 두경부 및 유방과 같은 여러 유형의 종양에 가장 자주 사용되는 약물이다[54, 55]. 그것은 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR), 테트라히드로폴레이트 및 티미딜산과 퓨린 합성에 필요한 부산물의 생산에 기여하는 효소를 억제하며 둘 다 세포 성장과 세포 증식에 필수적입니다. 따라서 DHFR 메토트렉세이트를 차단하면 4가지 기본 거대분자인 DNA, RNA, 티미딜레이트 및 단백질의 합성이 방지됩니다[56].
불행히도 대부분의 기존 PTT 제제와 마찬가지로 주요 과제는 전신 주사 후 표적 조직에서 GNP를 선택적으로 축적하는 것입니다[57,58,59]. 표적 암 치료법은 정상적인 건강한 세포의 노출을 줄이면서 특정 암세포에 화학 요법 약물을 전달할 수 있습니다. 이를 통해 우리는 더 낮은 전신 독성으로 더 많은 양의 약물을 암세포에 전달할 수 있었습니다. 리간드 표적 나노입자는 암 세포 표면에서 고도로 발현되는 정확하게 식별된 암 세포 마커이다[40].
엽산(엽산 또는 비타민 B9)은 세포 성장과 신진대사의 핵심 물질입니다. 엽산 수용체 단백질에 대한 엽산의 친화력이 크기 때문에 암 표적화를 위한 요소로 활용됩니다. 엽산 수용체는 종양 바이오마커로서 유방암, 난소암, 폐암, 신장암, 뇌암, 결장암과 같은 명확한 악성 세포에서 과발현된다[60]. 엽산 결합 약물 전달 시스템은 세포내이입을 통해 약물의 세포 흡수를 향상시킵니다[61].
실험을 위해 이중 증류수(Ghazi Company, Tabriz, Iran)와 분석 등급의 화학 시약을 사용했습니다. 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS, 98%), (3-메르캅토프로필) 트리메톡시실란(MPTES, 95% 순도), 엽산 및 로다민 B를 비롯한 여러 시약을 Sigma-Aldrich Company에서 구입했습니다. 재료 그룹은 Merck에서 구입했습니다. Co:염산(HCl, 37%), 암모니아 용액(25%), 톨루엔 수산화나트륨(NaOH, 98%) 및 추가 용매. MTX는 이란 타브리즈의 Zahravi Farma Company에서 구입했습니다.
본 연구에서는 입자의 크기와 형태를 분석하기 위해 투과전자현미경(TEM)(LEO 906, Germany)을 사용하였다. 실온에서 수용액에 현탁된 약 100μL의 나노 입자를 준비했습니다. 용액을 TEM의 구리 그리드에 코팅된 탄소 필름으로 옮기고 동결 건조하여 80KV에서 관찰하였다. Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 25°C에서 DLS(동적 광산란) 측정에 의해 입자 크기를 결정했습니다. 준비된 NP에 대한 제타 전위 측정은 광자 상관 분광법(Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, UK)에 의해 수행되었습니다. 이중 빔 UV-Vis 분광 광도계(UV-1601 PC model SHIMADZU, Kyoto, Japan)는 10mm 경로 길이를 갖는 700μL 석영 큐벳으로 흡광도를 측정하는 데 사용되었습니다. 독일 Bruker Tensor 27 분광기의 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광기를 KBr 펠렛 방법 수행에 사용했습니다. pH 측정은 Metrohm 713 pH 미터(Herisau, Switzerland)로 수행되었습니다. 기계적 교반기 Heidolph RZR 2102 제어 오버헤드 교반기(Schwabach, Germany)를 교반에 사용하였다. FA 및 MTX의 캡슐화 효율은 UV-vis 검출기 Waters 2500 Pump 1000 검출기가 장착된 Waters 2690 분리 모듈로 구성된 HPLC 시스템을 사용하여 계산되었습니다(Waters, Milford, MA). 크로마토그래피 분리는 C18 m Bondapak(250 mm 4.6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Ireland) 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 주변 온도에서 수행되었습니다.
SiO2 나노입자는 이전에 보고된 졸-겔 방법을 기반으로 합성되었다[62, 63]. 다음 단계에서 티올 기능화된 실리카 코팅 나노입자(TFSNP)는 이전 연구에서 언급된 방법에 따라 준비되었습니다[64]. Au 나노입자는 구연산염 환원법(Turkevich 방법)으로 제조하였다[65]. 마지막으로, TFSNP의 표면은 AuNP로 덮였습니다. 처음에 TFSNPs는 목욕 초음파기의 도움으로 적어도 1시간 동안 물에 분산되었고 AuNPs 용액에 첨가되었고 추가로 30분 동안 초음파 처리되었습니다. 반응은 25°C에서 동적 교반 하에 2일 동안 어두운 조건에서 수행되었습니다. Au@SiO2 보라색으로 보이는 나노입자를 원심분리(10000rpm, 10분)로 수집하고 진공 오븐에서 건조했습니다.
MTX 및 FA가 Au@SiO2에 로드되었습니다. 나노캐리어를 다음과 같이:MTX(10 mg)를 PBS(5 mg/mL, pH 7.4) 중 나노캐리어의 10 mL 잘 분산된 현탁액에 첨가하고 어두운 조건에서 하루 동안 실온에서 적당히 교반했습니다. MTX 로드 Au@SiO2 나노캐리어를 원심분리에 의해 수집하였다. 언로딩된 MTX의 측정을 위해 상청액을 수집하였다. 그런 다음 MTX는 Au@SiO2를 로드했습니다. 나노캐리어를 PBS(5 mg/mL, pH 7.4)에 분산시키고 FA(10mg)를 용액에 첨가하고 어두운 조건에서 다른 날 동안 실온에서 적당히 교반하였다. FA-MTX 로드 Au@SiO2 나노캐리어는 원심분리에 의해 수집되었고 상층액은 최종 단계에서 결합되지 않은 FA의 계산을 위해 분리되었습니다. FA-MTX 로드 Au@SiO2 나노캐리어를 동결건조하고 다음 실험을 위해 보관하였다. 결합되지 않은 MTX 및 FA의 양은 이전에 보고된 프로토콜에 따라 HPLC 방법을 사용하여 계산되었습니다[66]. 엽산을 수산화암모늄(10wt%)에 녹이고 이동상으로 희석하였다. MTX와 Folic acid의 머무름 시간은 각각 10.5분과 5.95분이었습니다. 3중 샘플을 적용했습니다. 약물 로딩 효율(DLE)은 다음 공식으로 계산되었습니다.
$$ ee\left(\%\right)=\frac{\left( 초기\ 총\ 약물- 비흡수\ 약물\오른쪽)}{ 초기\ 총\ 약물}\times 100 $$ (1)MCF-7 및 MDA-MB-231을 포함하여 표면 발현 수준이 보고된 엽산 수용체(FR)[67]를 가진 두 개의 관심 유방암 세포주가 세포독성 조사를 위해 Pasteur Cell Bank(이란 테헤란)에서 선택 및 구입되었습니다. 선택된 세포주는 37°C, 5% CO2의 열 및 대기 조건에서 RPMI1640(Thermoscientific), 10% Fetal bovine serum(FBS) 및 1% Penstrep(Thermoscientific)을 포함하는 완전 배지에서 성장되었습니다. 하위> , 95% 습도.
레이저 조사 없이 다양한 NP 처리 후 세포 증식을 측정하기 위해 세포 생존력 분석을 수행했습니다. 요약:MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 1.5×10 4 의 세포 밀도로 96개의 마이크로플레이트에 플레이팅했습니다. 24시간 동안 세포를 MTX, Au@SiO2로 처리했습니다. 및 FA-MTX 로드 Au@SiO2 NP. 처리하지 않은 세포를 대조군으로 간주하였다. 다음 단계에서 최종 농도가 5㎍/ml인 테트라졸륨 염료 MTT(Sigma)를 세포에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 MTT 용액을 제거하고 침전된 Furmazan 결정을 DMSO(Dimethyl Sulfoxide)(BioIdea, Iran)에 10분 동안 부드럽게 흔들어 녹였습니다. 마지막으로 ELISA 리더로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존력은 대조군 세포에 대해 정규화되었고 배경은 블랭크 측정의 빼기로 제거되었습니다.
LLLT(Low Level Laser Therapy)의 경우 185mW 출력의 810nm 파장 NIR 레이저(Diode laser Mustang 2000, Russia)가 암세포 파괴에 사용되었습니다. 처음에는 세포 밀도가 1.5×10 4 인 MCF-7 및 MDA-MB 231 세포 Au@SiO2로 처리 및 FA-MTX 로드 Au@SiO2 그런 다음 NP를 다양한 레이저 조사량(30, 60, 75, 90 및 105J/cm 2 ) 및 고정 노출 시간(139초). 레이저 조사에만 노출된 세포(NP 없음) 및 NP 및 레이저 처리가 없는 세포는 각각 양성 및 음성 대조군으로 간주됩니다. 24시간의 레이저 조사 후 세포 생존율을 MTT assay 방법으로 측정하였다[64].
각 세포주에 대한 표면 개질된 나노캐리어의 특정 효과를 확인하기 위해서는 NP 세포 내재화에 대한 자세한 확인이 필수적입니다. 현재 작업에서 우리는 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포주에 의한 NP 흡수를 정성적으로 확인하기 위해 정량 및 형광 현미경으로 유세포 분석기를 사용했습니다.
NP의 현탁을 위해 PBS 중 로다민 B(RhoD) 용액을 주위 온도 및 암실(표백 방지)에서 24시간 동안 교반하면서 첨가했습니다. 그런 다음, RhoD가 로딩된 NP를 30kDa의 공칭 분자량 한계(NMWL)로 Amicon 필터로 분리하고 5000rpm에서 15분 동안 원심분리하고 PBS 완충제로 세척하여 결합되지 않은 RhoD를 제거했습니다. 세포를 5×10 5 의 밀도로 플레이트에 접종했습니다. 잘 당하고 합류점에 도달하게 하십시오. 세포를 30분, 90분 및 180분 동안 로다민 B가 로딩된 NP로 처리하고, 처리하지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. 이후, 세포를 트립신 처리하고 PBS로 세척한 후 유세포 분석(BD Biosciences FCASCalibur 유세포 분석기; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)으로 형광을 정량화하였다. 로다민 B-표지된 NP 또는 NPD의 세포내 흡수는 형광 현미경에 의해 추가로 확인되었다. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 커버슬립에서 성장시키고 24시간 후 세포를 유리 Au@SiO2로 처리했습니다. NP 및 MTX-FA 로드 Au@SiO2 NP. 30, 90 및 180분 동안 배양한 후 세포를 PBS로 세척하고 형광 현미경(Olympus 현미경 Bh2-FCA, 일본)을 사용하여 로다민 B로 표지된 나노운반체 흡수를 관찰했습니다.
세포자살의 핵 정성 연구를 위한 한 가지 방법은 DNA에 결합하고 적절한 현미경으로 검출할 수 있는 형광 염료 DAPI입니다. 우리는 이전에 DAPI 염색에 대해 보고된 프로토콜을 사용했습니다[68]. MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 5 ×10 5 밀도로 6웰 형식 용기에 플레이팅했습니다. 그리고 24시간 동안 붙이고 자라게 하십시오. MTX 처리 후, Au@SiO2 NP 및 MTX-FA 로드 Au@SiO2 레이저 처리가 있거나 없는 NP는 PBS(Sigma)로 세척한 다음 10% 포름알데히드(Merck)로 고정한 다음 Triton X-100(Sigma)으로 15분 동안 세포를 투과화했습니다. 적절한 세척 후, 세포를 5분 동안 DAPI(시그마)로 염색하였다. 마지막으로, 형광 현미경(Olympus)으로 세포사멸 핵(조각 또는 주름진)을 가시화했습니다. 아무런 처리도 하지 않은 세포는 음성대조군으로, 레이저만 조사한 세포는 양성대조군으로 하였다.
MCF-7 및 MDA-MB-231 세포 주기 분포는 유세포 분석에 의해 결정되었습니다. 이러한 방식으로 세포는 5 × 10 5 의 시작 인구로 시드되었습니다. 80% 합류에 도달하도록 허용했습니다. 이어서, MTX, Au@SiO2로 처리된 세포 NP 및 MTX-FA 로드 Au@SiO2 레이저 조사가 있거나 없는 NP를 수행했습니다. 아무런 처리도 하지 않은 세포를 음성 대조군으로 간주하고 레이저 조사만 받은 세포를 양성 대조군으로 하였다. 그런 다음, 적절한 PBS 세척 후 트립신 처리에 의해 세포를 수확했습니다. 다음으로, 세포를 48시간 동안 에탄올(Merck)로 고정하였다. 다음 단계에서 고정된 세포를 세척한 다음 리보뉴클레아제 A(Cinaclone)로 처리하고 어두운 곳에서 프로피디움 요오드화물(PI)(Sigma)을 후속적으로 첨가했습니다. 형광 신호는 Beckton Dicinson Company에서 설정한 FACS에 의해 검출되었습니다.
각 단계에 대한 실험은 3회 반복 수행되었으며 결과는 평균 ±SD로 보고되었습니다. ANOVA는 그룹 간의 유의성을 비교하는 데 사용되었습니다. 차이는 확률 값이 SPSS 소프트웨어에 의해 <0.05로 계산된 경우 유의성을 반영했습니다.
Au@SiO2 NP는 4단계로 생성되었습니다. 1-SiO2 합성 나노입자, 2-SiO2 나노입자에 링커 함유 티올 첨가, 3-금 나노입자 합성, 4-SiO2-링커 복합체 표면에 금 나노입자 부착(그림 1). Au@SiO2의 성공적인 합성 FTIR에 의해 확인되었습니다(그림 2a). Si-O-Si 피크는 약 1088 cm -1 에 나타났습니다. . 3000–3700 및 803cm의 넓은 피크 –1 자유 실라놀 O-H 그룹의 스트레칭 및 평면 외 굽힘에 각각 기여합니다. 지방족 C-H 신축진동은 2950 cm –1 에서 강한 피크로 나타났다. . 3개의 메톡시실란기의 CO-O는 1191cm -1 에서 피크로 나타났습니다. .
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엽산 및 메토트렉세이트 로딩 생체 적합성 Au@SiO2의 제조를 위한 단계별 합성 계획 NPs 나노입자
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아 ) Au@SiO2의 FTIR 스펙트럼 나노입자, b ) FA-MTX 접합 Au@SiO2의 크기 분포 동적 광산란(DLS) c으로 측정한 NP ) Au@SiO2의 제타 전위 및 FA-MTX 접합 Au@SiO2 pH=7.4 및 T=25°C에서 동적 광산란(DLS)으로 측정한 NP, d ) FA-MTX 접합 Au@SiO2에서 분리된 무부하 MTX 및 FA의 크로마토그램 HPLC 방법으로 동시에 측정된 NP
동적 광산란(DLS) 측정은 FA-MTX가 Au@SiO2를 접합한 것으로 나타났습니다. NP의 크기는 나노미터 범위(105±2.3 nm)에 있었고 좁은 크기 분포를 보였습니다(그림 2b).
제타 전위는 나노현탁액의 안정성에 영향을 미치는 중요한 물리화학적 매개변수입니다. 극도로 양의 또는 음의 제타 전위 값은 더 큰 반발력을 유발합니다. 다른 한편으로, 입자의 높은 전하량은 양성이든 음성이든 간에 NP가 간의 식세포에 의해 흡수되어 신체를 처분하도록 합니다. 정전기 및 입체 안정화가 결합된 경우 ±20mV의 최소 제타 전위가 바람직합니다[69,70,71]. NP의 제타 전위 데이터는 pH =7.4 및 T =25 °C에서 MTX-FA 로딩 전후를 비교했습니다(그림 2c). 얻어진 Au@SiO2의 제타 전위 NP는 이중 약물 로딩 후 바람직한 범위에 있는 -19.7 mV로 감소한 +13.3 mV였습니다. MTX와 FA는 pH(7.4)에서 pka(3.8 및 4.8, 3.5 및 4.3)보다 높은 순전하를 띠며, 이는 구조([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). 따라서 Au@SiO2에 MTX와 FA 동시 로딩 후 NP, 순전하가 음수가 되었습니다.
TEM 분석은 명확한 개별 입자 크기를 제공합니다. Au 나노 입자는 회색 베드 층으로 SiO2 NP에 분산된 어두운 구체로 보였다. TEM 이미지를 통해 Au@SiO2 나노입자가 평균 입자 크기가 약 25nm인 균일한 구형으로 합성되었음을 확인했습니다(그림 3).
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Au@SiO2의 TEM 이미지 나노입자
여기서, 엽산은 수용체 매개 세포내이입을 통해 엽산 수용체를 과발현한 특정 유형의 암세포에서 GNP의 증가된 흡수를 매개하여 GNP의 내재화의 낮은 효능을 압도하기 때문에 종양 표지자로 알려진 엽산 수용체 및 종양에 대한 엽산 사용 증가 타겟팅 [67, 73].
Au@SiO2로 MTX 및 FA 분자 접합 후 NP, 제타 전위는 +13.3에서 -19.7 mV로 변경되었습니다. MTX의 두 카르복실산 부분의 추정된 pKa 값은 3.8, 4.8이고 FA는 3.5 및 4.3입니다[72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 따라서 pka보다 높은 pH 7.4에서 MTX와 FA의 두 카르복실산 기의 탈양성자화로 인해 순전하는 음이 되었고 Au@SiO2에서 MTX와 FA의 성공적인 접합을 나타냅니다.> NP. De Ying Tian et al은 18 및 30 mm 직경의 Au 나노입자에 대한 MTX 로딩이 각각 15 ± 0.4% 및 10 ±1.0%임을 보여줍니다[74]. 이 연구에서 FA와 MTX는 각각 22.6%와 77.5%의 캡슐화 효율로 Au@SiO2 나노입자에 로딩되었습니다. MTX 및 FA 동시 평가 피크의 크로마토그램은 그림 2d에 나와 있습니다.
세포내 광열치료제는 광열암 치료의 효율을 높일 수 있기 때문에[75], 광열 물질의 세포 내재화가 필요하다고 여겨져 왔다. 시험관 내 세포 흡수 테스트는 엽산 수용체를 고도로 과발현하는 것으로 알려진 인간 유방암 MDA-MB-231 세포를 사용하여 수행되었습니다[40]. 표적화제로서의 FA의 역할과 Au@SiO2의 흡수에 대한 표면 코팅의 효율성 연구 표적 세포, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에 의한 NP는 Au@SiO2 NP 및 MTX-FA가 로딩된 Au@SiO2 NP로 처리되었다. 세포 흡수의 평균 형광 강도 결과는 그림 4에 나와 있습니다. 결과는 MCF-7과 MDA-MB-231 모두에서 Au@SiO2 나노입자 흡수가 모든 샘플에 대해 세포 배양 시간에 따라 증가함을 보여주었습니다(그림 4 및 5). ). 또한, MTX와 FA로 Au@SiO2 나노입자의 표면 장식 후, 세포 흡수는 엽산 수용체 발현 세포로서 MCF-7과 MDA-MB-231 모두에서 유의하게 증가하였다. MTX-FA가 로드된 Au@SiO2 NPs가 MDA-MB-231 세포로 흡수되는 것은 MCF-7보다 더 컸습니다. MDA-MB-231 세포는 더 높은 수준의 표면 엽산 수용체를 발현하므로 엽산 수용체 표적 NP의 높은 부분이 수용체 매개 세포내이입 기전을 통해 입력되어 더 높은 세포 흡수를 초래합니다. 또 다른 연구에서 엽산 접합 NP의 증가된 세포 내재화는 aHFR의 세포 표면 발현이 적은 건강한 세포가 아니라 aHFR을 과발현하는 암세포에서만 발생합니다[40]. Au@SiO2 나노입자와 FA의 접합은 나노입자와 메토트렉세이트의 세포 흡수를 촉진하여 MDA-MB-231 세포에 대한 독성을 높일 수 있습니다[76].
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로다민 B-표지 Au@SiO2의 정량적 세포 흡수 분석 나노입자(NP) 또는 로다민 B-표지 MTX-FA 로드 Au@SiO2 MCF-7의 나노입자(NPD)(a ) 및 MDA-MB-231(b ) 유세포 분석에 의해 얻은 0.5시간, 1.5시간 및 3시간의 노출 기간에 대한 세포주. 두 세포주의 비처리 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. ㄷ 로다민 B로 표지된 Au@SiO2의 평균 형광 강도 비교 나노입자(NP) 또는 로다민 B-표지 MTX-FA 로드 Au@SiO2 유세포 분석으로 얻은 0.5시간, 1.5시간 및 3시간의 노출 기간 동안 나노입자(NPD)
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A Rhodamine B-labeled Au@SiO2를 사용한 정성적 세포 흡수 분석 노출 기간이 30인 MCF7의 나노입자(NP)(a ), 90(b ) 및 180(c ) 최소 또는 로다민 B-표지 MTX-FA 로드 Au@SiO2 노출 기간이 30인 나노입자(NPD)(d ), 90(e ) 및 180(f ) 분 및 (B ) 로다민 B-표지 Au@SiO2를 사용한 정성적 세포 흡수 분석 노출 기간이 30인 MDA-MB-231의 나노입자(NP)(a ), 90(b ) 및 180(c ) 최소 또는 로다민 B-표지 MTX-FA 로드 Au@SiO2 노출 기간이 30인 나노입자(NPD)(d ), 90(e ) 및 180(f ) 형광 현미경으로 포착한 분
유리 MTX, 공란 Au@SiO2의 시험관 내 세포 독성 연구 NP 및 MTX-FA 접합 Au@SiO2 NP는 24시간, 48시간 및 72시간 동안 MTT 분석으로 평가되었습니다(그림 6). MTT 분석 결과는 Au@SiO2 NP는 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포주에 대해 세포독성 효과가 없었다. 또한, 유리 MTX 및 MTX-FA 접합 Au@SiO2의 세포 독성 효과를 비교하기 위해 NPs, 동일한 농도의 MTX(25, 50, 100 및 200μg/mL)가 모든 처리 시간에 사용되었습니다. 세포 독성 결과는 유리 MTX 또는 MTX-FA가 Au@SiO2 접합됨을 나타냅니다. NP는 처리 24시간 후 두 세포주에서 약 10-25%의 사망률을 보였다. 이전 연구에서는 시험관 내 조건에서 뮤린 조골세포 MC3T3-E1 세포 및 인간 치주 인대 줄기 세포와 같은 다양한 세포주에 대한 금 나노입자의 증식 효과를 보고했습니다. 우리의 결과는 이러한 연구와 일치하며 그림 6a와 b는 유리 Au@SiO2 NP의 증식 효과를 보여줍니다. 따라서 MTX와 FA-MTX가 로딩된 Au@SiO2 나노입자(NPD)의 동일한 세포독성 효과는 이러한 현상 때문일 수 있습니다[77, 78].
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아 MCF-7 및 (b ) 다른 농도의 NP, MTX 및 FA-MTX 로드 Au@SiO2로 처리한 후 MDA-MB-231 세포 성장 억제율 24, 48, 72시간 노출 후 나노입자(NPD)
이 연구에서 Au@SiO2로 처리된 MCF-7 및 MDA-MB 231 세포의 세포 생존율 NP 및 MTX-FA 로드 Au@SiO2 30-105 J/cm 2 범위의 선량으로 레이저 조사 후 NP MTT assay로 조사했습니다. MTX-FA가 로드된 Au@SiO2로 처리된 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포의 사망률 75 J/cm2의 용량에서 LLLT 후 NP(MTX 농도는 100 μg/mL) 각각 약 39%와 45.5%였다. 동일한 조건에서 Au@SiO2로 처리된 세포 레이저 조사 또는 레이저 단독 후의 NP는 명백한 세포 사멸을 나타내지 않았다. 또한 레이저 선량을 105J/cm 2 로 증가시켜 Au@SiO2로 처리한 두 세포주의 사망률이 60-75%로 증가했습니다. 동일한 조사량에서 나노입자 + 레이저 또는 레이저 단독은 세포독성 효과를 나타내지 않았다. MTX-FA가 로드된 Au@SiO2와의 병용 요법 후 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에 대한 IC50 값 NP(100μg/mL의 MTX 용량) 및 LLLT는 90 및 75J/cm2의 용량에서 획득되었습니다. , 각각. 반면에 Au@SiO2를 적재한 MTX와 MTX-FA의 사망률은 100㎍/mL의 MTX 용량(레이저 요법 연구를 위해 선택된 용량)에서 레이저 조사가 없는 NP는 두 세포주에서 15-25% 사이였습니다. 이러한 결과는 MTX-FA의 조합이 Au@SiO2를 로드했음을 나타냅니다. 나노입자와 레이저 요법은 두 세포주 모두에서 시너지 효과를 보였고 세포 생존력을 현저히 감소시켰습니다(p <0.001) 레이저만 조사한 세포에 비해. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).
A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm 2 ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h
The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO2 NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO2 NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO2 NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO2 NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm 2 , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO2 NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.
Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm 2 ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO2 nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm 2 ) and Au@SiO2 nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )
Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO2 NPs and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs either in combination with LLLT (75 J/cm 2 ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm 2 laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.
Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm 2 ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO2 nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm 2 ) and Au@SiO2 nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution
Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.
In this study MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO2 nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.
Not applicable
Silica coated gold
Breast cancer
Dihydrofolate reductase
Dimethyl Sulfoxide
Folate
Low level laser therapy
국부적인 표면 플라즈몬 공명
Mesoporous silica nanoparticle
Methotrexate
Near-infrared
나노입자
Photothermal therapy
rhodamine B
Thiol-functionalized silica-coated nanoparticles
나노물질
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
