다제내성 위암에 대한 시너지 화학요법을 위한 Paclitaxel 및 P-gp 수송 억제제가 탑재된 PD-L1 단클론항체 장식 나노리포좀

결과 및 토론

PTX/TQD 로딩 PD-L1 접합 나노리포좀의 제조 및 특성화

PTX는 클리닉에서 널리 사용되어 왔으며 주로 위암 치료에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 환자는 위암의 다제내성(MDR)으로 인해 치료 반응이 좋지 않은 것으로 보입니다. PTX의 용량 증가는 전신 독성을 증가시켜 MDR이 성공적인 암 치료 치료의 주요 장애물이 되었습니다. 과다한 MDR 기전 중 p-gp 매개 약물 유출은 암세포의 약물 내성에 주로 책임이 있는 것으로 간주됩니다[27]. 따라서 본 연구에서는 암세포의 MDR 현상을 극복하고 PTX의 항암 효능을 향상시키기 위해 두 번째 약물(TQD)을 p-gp 억제제로 사용하였다. 우리는 시너지 효과를 나타내는 두 약물의 중량 분율을 주의 깊게 연구했습니다. 항암 효과를 극대화하기 위해서는 단일 나노 입자 시스템에서 여러 약물을 공동 전달하는 것이 중요합니다. 두 가지 약물(PTX 및 p-gp 억제제)을 동시에 전달하면 약물 유출 메커니즘을 효율적으로 억제할 수 있고 암세포의 세포 내 농도 증가 가능성이 높아집니다[28]. 이를 위해 이 연구에서는 전신 순환에서 매우 안정적인 것으로 간주되는 나노리포좀의 지질 이중층에 두 가지 약물을 로드했습니다(그림 1). 향상된 종양 특이적 표적화를 달성하기 위해 나노리포좀을 PD-L1 mAb와 표면 접합시켰다. 나노리포솜에 존재하는 말레이미드 그룹은 PD-L1 mAb의 티올 그룹과 결합하여 안정적인 공유 결합을 형성합니다. 그러나 말레이미드 접합의 가능한 한계는 반응이 가역적이라는 것입니다. 즉, 생성물은 혈장 내 생물학적 티올과 역-마이클 첨가 반응을 겪을 수 있어 말레이미드의 방출로 이어질 수 있습니다. 그러나 우리는 말레이미드-리포솜에 항체의 최대 표면 접합으로 이러한 반응을 극복했습니다. 종양 표적 리간드는 종양 조직에서 치료 부하를 특이적으로 전달하고 정상 조직에서 불필요한 부작용을 피하는 것으로 보고되었습니다. 이전에 Patel et al. PTX와 함께 p-gp 억제제를 통합하면 시험관 내 조건에서 난소암 세포의 MDR을 극복할 수 있다고 보고했습니다[11]. 유사하게, Zou et al. 및 Zhang et al. SKOV-3TR 및 A2780-Adr 다제내성 세포에 대한 PTX 세포독성은 Tariquidar의 존재하에 유의하게 증가했다고 보고했습니다. 그러나 이러한 연구에서는 PTX + TQD의 물리적 조합을 사용하거나 비표적 운반체를 개발했습니다[29, 30]. 중요하게도, 이러한 모든 연구는 시험관 내 조건에서만 수행되었습니다. 현재 연구는 비교적 새로운 종류의 표적화제인 PDL1 항체를 사용하여 표적화된 나노운반체를 설계하는 데 초점을 맞췄습니다. 또한, 본 연구는 이종이식 종양 모델에서 PTX + TQD의 효능을 입증하고 전신 독성과 관련된 혈액 매개변수를 평가했습니다.

PD-L1 단일클론항체(mAb)-표면 접합 나노리포좀에서 파클리탁셀 및 타리퀴다르 로딩의 개략도. 리포솜은 얇은 지질막의 수화에 의해 제조되고 초음파 처리되어 약물이 로딩된 나노리포솜을 형성합니다

PTLP의 평균 입자 크기는 135.6 ± 1.26 nm인 반면 PD-L1 mAb(PD-PTLP)와의 접합 후 168.59 ± 1.34 nm로 증가했습니다. PD-L1 mAb의 큰 분자량으로 인해 입자 크기가 증가했습니다. 그럼에도 불구하고 전체 크기가 200 nm 미만이고 구형이 주목할 가치가 있는 점이었습니다(그림 2a). 200 nm 미만의 나노입자 크기는 향상된 투과 및 보유(EPR) 효과로 인해 종양 조직에 더 많이 축적될 수 있습니다. 게다가, PEG의 존재는 전신 순환에서 연장된 혈액 순환 시간을 허용할 것입니다. PD-PTLP의 제타 전위는 22.1 ± 1.21 mV로 혈액 성분에 대한 비특이적 결합을 허용하지 않습니다. PD-PTLP는 두 약물(PTX 및 TQD)에 대해 ~ 95%의 높은 포획 효율을 나타냈습니다. PD-PTLP는 또한 PTX와 TQD에 대해 각각 12-14% w/w의 높은 약물 부하를 나타냈다(그림 2b).

PTX/TQD 로딩 PD-L1 접합 나노리포솜의 물리화학적 특성. 아 투과전자현미경(TEM)을 이용한 PD-PTLP의 형태 분석. ㄴ PD-PTLP의 약물 로딩 용량. ㄷ 37°C에서 pH 7.4 완충제 및 pH 5.0 완충제 조건에서 PD-PTLP로부터 PTX 및 TQD의 시험관 내 방출. **p <0.01은 pH 7.4와 pH 5.0 완충액 사이의 약물 방출의 통계적 차이입니다.

체외 약물 방출

PD-PTLP로부터의 PTX 및 TQD의 방출 거동은 37°C의 pH 7.4 및 pH 5.0 조건에서 연구되었습니다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 연구 기간(72시간) 동안 PD-PTLP로부터 약물(PTX 및 TQD)의 제어 방출이 관찰되었다. 나노리포좀의 두꺼운 이중층에서 약물의 방출은 PD-PTLP에서 두 약물의 느리고 지속적인 방출을 담당할 수 있습니다. pH 7.4 및 pH 5.0에서 PTX 및 TQD의 방출 패턴에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다는 점에 유의해야 합니다. 더 긴 시간 지점에서 상당한 차이는 다른 pH 조건에서 방출이 관찰되었다는 것입니다. 나노리포좀에 pH 반응성 요소가 추가되지 않았으며 산성 조건에서 더 높은 약물 방출은 더 낮은 pH에서 더 높은 확산에 기인할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 예를 들어, pH 5.0 조건에서 PTX의 ~ 85%가 생리학적 pH 환경에서 약 ~ 55% 방출됩니다. 산성 조건에서 소분자의 빠른 방출과 염기성 pH 조건에서의 느린 방출의 유사한 패턴이 다른 연구자에 의해 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 pH 7.4 조건에서 상대적으로 낮은 약물 방출은 불필요한 전신 부작용을 줄이고 전신 순환을 연장할 수 있는 반면 pH 5.0에서 더 높은 약물 방출은 종양 조직에서 더 높은 치료 효능에 도움이 될 수 있습니다.

체외 세포 흡수 분석

표적(PD-PTLP) 및 비표적(PTLP) 나노리포좀의 전달 효율은 SGC7901/ADR에서 테스트되었습니다. 세포 흡수는 형광 추적기로 로다민-B를 사용하여 평가되었습니다. 로다민-B는 세포 생물학적 상호작용이 없는 일반적으로 사용되는 형광단입니다. 핵은 파란색 DAPI로 염색되었고 나노 입자에서 유래한 빨간색이었습니다. CLSM 데이터는 PD-PTLP가 비표적 PTLP와 비교하여 암세포에서 강한 적색 형광을 나타내었음을 분명히 보여줍니다. PD-PTLP 처리된 암세포에서 더 높은 적색 형광은 더 높은 나노입자 내재화에 기인합니다(그림 3a). CLSM 데이터의 결과는 세포막에 발현된 PD-L1 수용체가 나노리포솜 표면에 접합된 PD-L1 mAb에 의해 인식되었음을 나타냅니다. 비특이적 또는 수동적 흡수 기전은 PTLP 처리된 암세포에서 분명했습니다. PD-L1 표적 특이성은 PD-L1 mAb 전처리 실험에 의해 추가로 확인되었다. SGC7901/ADR 세포를 PD-L1 mAb로 전처리하고 30분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 세포를 PD-PTLP 및 PTLP에 노출시키고 3시간 동안 인큐베이션하였다. 도시된 바와 같이(도 3b), PD-L1 mAb로 전처리된 세포는 비처리된 세포와 비교하여 현저히 적은 적색 형광을 나타내어 PD-L1 mAb가 표면-발현된 수용체에 의해 소비되었고 결합에 사용할 수 있는 추가 수용체가 없음을 나타냅니다. 및 내재화를 통해 나노입자의 흡수를 줄이고 내재화를 줄입니다. 이러한 CLSM은 SGC7901/ADR 암세포에서 PD-PTLP의 표적화 특이성을 분명히 드러냈습니다.

아 3시간 동안 PTLP 및 PD-PTLP와 함께 배양한 후 SGC7901/ADR 세포의 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미지; PD-PTLP와 함께 3시간 동안 배양한 후 PD-L1 mAb가 있거나 없는 전처리된 SGC7901/ADR 세포의 CLSM 이미지. Rhodamine B는 형광 추적기로 사용되었으며 DAPI는 암세포의 핵을 염색하는 데 사용되었습니다.

이중 약물이 탑재된 나노리포좀은 항증식 효과를 향상시킵니다.

병용 요법의 경우 두 약물(PTX 및 TQD)의 다른 비율을 사용하여 내성 위암 세포에 대한 상승 또는 상가 효과의 정도를 설정했습니다. 이소볼로그램 및 조합 지수(CI)를 계산하기 위해 CalcuSyn 소프트웨어(Biosoft, 버전 2.1)를 사용했습니다. isobologram 플롯은 Chou-Talalay 방정식을 기반으로 설명할 수 있습니다. CI 값은 상승적(CI <0.9), 추가(CI =1) 및 길항(CI> 1)으로 특성화됩니다. 도시된 바와 같이, PTX와 TQD의 모든 조합 비율은 시너지 작용 메커니즘을 의미하는 <1의 CI 값을 나타냈다(그림 4a). 구체적으로, 1/0.5(P/T)의 중량분율에서 가장 높은 상승효과를 보인 반면, TQD 중량분율이 증가함에 따라 상승효과 수준은 감소하여 특정 중량분율에서 두 약물의 존재의 중요성을 시사하였다. 조합 요법에서 TQD의 농도가 너무 낮거나 너무 높으면 최상의 시너지 효과를 내지 못했습니다. 모든 시험관 내 실험에 대해 P/T =1/0.5 비율을 연구에서 사용했습니다.

아 SGC7901/ADR 세포에서 PTX 및 TQD의 다양한 중량 분획의 조합 지수(CI). 조합 지수는 Calcusyn ^TM 에 의해 평가되었습니다. 소프트웨어. ㄴ 24시간 배양 기간 동안 다양한 농도의 유리 PTX, TQD, PTLP 및 PD-PTLP로 처리한 후 SGC7901/ADR 세포의 시험관 내 세포 생존율. ㄷ 각 제형으로 처리한 후 SGC7901/ADR 세포에서 p-gp 발현의 웨스턴 블롯 분석. **p <0.01 및 ***p <0.001은 자유 PTX와 PD-PTLP 처리군의 통계적 차이입니다.

24시간 배양 후 MTT 프로토콜에 의해 개별 약물 및 복합 약물의 시험관 내 세포독성 효과를 측정했습니다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 블랭크 NP는 최종 결과에 대한 간섭 가능성을 배제하는 세포 생존력에 어떠한 영향도 미치지 않았다. PTX 및 TQD 단독 요법은 내성 위암 세포에서 농도 의존적 ​​세포독성 효과를 나타내었지만; 치료에 있어 눈에 띄는 효과에 미치지 못했습니다. 단일 제제의 항증식 효과는 나노리포좀에 봉입된 제2 약물과 병용 시 현저히 개선되었다. The combination of PTX and TQD resulted in obvious synergistic effect compared to that of individual drugs alone. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

아 Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. ㄴ Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. ***p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0.001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ , and ~ 650 mm ³ , 각각. Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0.001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; 아 tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. *p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; 아 mice body weight analysis; ㄴ , ㄷ blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. *p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group