PD-L1 항체 접합 나노리포좀을 통한 파클리탁셀과 P-gp 억제제 동시 전달로 다약제 내성 위암 극복
요약
ATP 의존성 유출 수송체(P-당단백질, P-gp)에 기반한 다약제 내성(MDR)은 성공적인 화학요법 치료의 주요 걸림돌로 남아 있다. 본 연구에서는 PD-L1 단일클론 항체(mAb) 접합 나노리포좀이 약물 내성 위암에서 파클리탁셀(PTX)과 P-gp 특이적 수송 억제제(TQD, 타리퀴다르)의 공동 전달을 위한 표적 전달 플랫폼으로서의 잠재력을 조사했다. 두 약물 PTX와 TQD를 정확한 비율로 단일 전달체에 공동 적재하여 병용 화학요법 효과의 전망을 높였다. 세포 내화 연구에서 PD-PTLP는 PD-L1 수용체를 과발현하는 SGC7901/ADR 세포에서 비표적 PTLP보다 높은 내화 효율을 보였다. PTX/TQD 중량비 1/0.5에서 최고 시너지가 관찰되었으며 PTX와 TQD의 병용은 단독 약물에 비해 명백한 시너지 효과를 나타냈다. 체외 결과에서 TQD가 SGC7901/ADR 세포의 다약제 내성을 역전시키는 데 효과적임이 입증되었다. PD-PTLP의 IC50 값은 0.76μg/ml로 PTX(6.58μg/ml)와 TQD(7.64μg/ml)에 비해 현저히 낮았다. PD-PTLP는 자유 PTX나 TQD에 비해 유의하게 높은 수준의 활성산소종(ROS)과 세포 사멸을 유도했다. 또한 체내 항종양 연구에서 PD-PTLP의 병용 화학요법이 약물 내성 이종이식 종양의 종양 부담을 유의하게 억제했으며 유의하게 높은 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 양성 세포를 보였다. 또한 자유 PTX는 AST와 ALT 수치를 유의하게 증가시킨 반면 PD-PTLP는 대조군과 유의한 차이가 없어 안전성을 입증했다. 전반적으로 항암제와 P-gp 억제제의 병용이 약물 내성 위암 종양 치료를 위한 잠재적 방향을 제공할 수 있다고 믿는다.
서론
단일 약물 요법 기반의 현재 화학요법 치료는 완벽하지 않으며 고용량에서 심각한 부작용을 겪고 동시에 약물 내성 발달을 초래한다[1]. 지난 10년간 암 치료에서 병용 약물 요법의 높은 치료 효과가 입증되었다[2]. 두 가지 이상의 약물 병용이 서로 다른 약리학적 작용으로 인해 시너지 항암 효과를 산출함이 입증되었다[3, 4]. 그러나 적절한 약물 조합 선택은 암세포 유형, 친수성/소수성 약물, 생화학적 활성, 약물의 약동학적 패턴 등 여러 요인에 의존한다. 무엇보다 약물 조합은 특정 암 유형에 선택적이다[5].
위암은 전 세계적인 건강 부담이며 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. 위암 유병률은 일본, 한국, 중국 등 동아시아에서 높으며 중국이 세계에서 가장 높은 사망률을 보고한다[6]. 평균적으로 중국에서 매년 40만 건의 새로운 사례가 등록되며 대부분 진행/말기에 진단된다[7, 8]. 치료 전략에서 엄청난 진전이 있었으나 생존율 개선에는 실패했고 치료 실패로 이어졌다. 치료 실패는 주로 화학내성 발달, 화학요법 용량의 심각한 독성, 위암 재발에 기인한다[9]. 따라서 치료 효능 개선과 위암의 전이 및 재발 극복이 시급한 과제다.
파클리탁셀(PTX)은 위암 치료에 사용되는 중요한 약물 중 하나다[10]. PTX는 마이크로튜불 분해 간섭으로 세포 복제를 억제하여 세포 주기 정지를 유도한다. 그러나 다약제 내성(MDR) 획득은 화학요법 성공 사이의 주요 걸림돌이다[11, 12]. P-당단백질(P-gp)이 풍부한 인자로 여겨지는 ATP 결합 카세트(ABC) 패밀리의 막관통 수송체에 의한 ATP 의존성 유출이 위암에서 과발현된다[13]. 달리 말하면 PTX는 P-gp 수용체의 기질로 작용하여 약물 유출이 세포 내 약물 농도를 감소시켜 낮은 효능과 높은 내성을 초래한다[14]. 이와 관련하여 타리퀴다르(TQD)는 강력한 3세대 P-gp 억제제로 여러 암세포에서 P-gp 수용체 과발현을 역전시키는 것으로 보고되었다[15, 16]. 그러나 보고에 따르면 TQD 투여는 정상 생리 시스템의 P-gp 기능을 방해하여 조기에 중단되어야 한다. P-gp 발현은 혈액-뇌 장벽(BBB) 유지와 정상 조직에서 독소 제거에 필요하다[17]. P-gp가 정상 조직에 존재하여 세포 독소에 대한 장벽 역할을 하므로 PTX나 TQD의 비특이적 억제는 정상 생리 기능을 잠재적으로 방해하고 부작용 독성을 초래할 수 있다. 게다가 PTX와 TQD는 수용액과 전신 혈액에서 제한된 용해도를 가진 고지용성 약물로, 체내 위암을 표적하는 안정적인 약물 전달 시스템의 필요성을 시사한다[18].
약물 전달 시스템(DDS)은 캡슐화된 약물의 암 조직 내 농도를 유의하게 증가시키고 장기간 약물의 지속적 방출을 제공한다[19]. 이와 관련하여 리포좀은 암에서 치료 효능을 개선하기 위해 널리 사용되는 약물 전달체다. 리포좀은 생체적합성, 구조적 표면 수정, 친수성/소수성 약물 적재, 높은 약물 적재 용량 등으로 중요성이 증가하고 있다[20]. 약물은 리포좀의 지질 이중층에 안정적으로 포함될 수 있으며 향상된 투과성 및 보유(EPR) 효과로 장시간 순환 능력(PEG화)을 쉽게 부여받을 수 있다[21]. 최근 리포좀이 정맥 투여 후 다중 약물 비율을 유지하는 능력이 보고되었다[22]. 이 아이디어는 2017년 FDA 승인 후 시타라빈:다우노루비신 비율을 포함한 Vyxeos®(리포좀 제형)가 백혈병 치료에 사용되면서 입증되었다[23]. 비표적 제형에 비해 리간드 표적 제형은 매우 매력적이고 유망하다. 이와 관련하여 PD-1은 면역 시스템 하향 조절과 T 세포 염증 활성 억제로 알려진 세포 표면 수용체다. PD-L1 발현이 위암 환자의 50%에서 보고되어 PD-L1이 나노입자 내재화를 위한 표적 수용체가 될 수 있다[24, 25]. PD-L1 단일클론 항체(mAb)는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있으며 항암 효능 향상을 위한 훌륭한 치료 전략이 될 수 있다[26].
본 연구의 주된 목적은 병용 약물 PTX와 TQD의 전달을 개선하여 위암에 대한 항암 효능을 높이는 것이다. 이를 위해 PTX와 TQD 적재 PD-L1/나노리포좀을 제조하고 체외 및 체내 조건에서 항암 효능을 평가했다. 체내 효능은 위암 세포 기반 이종이식 모델에서 평가했으며 면역조직화학(IHC)을 수행했다.
결론
결론적으로 본 연구는 프로그래밍된 전달 전략으로 MDR 종양에 대한 병용 요법을 실현했다. PTX와 P-gp 억제제(TQD)의 병용이 다약제 내성 SGC7901/ADR 이종이식 종양의 종양 부담 억제 잠재력을 입증했다. 다기능 나노캐리어에서의 PTX와 TQD 공동 전달은 공동 적재 항암제의 비율 제어를 허용하고 P-gp 유출 펌프를 억제하며 시너지 항암 효능을 나타냈다. 항암제와 P-gp 억제제의 병용이 약물 내성 종양 치료를 위한 잠재적 방향을 제공할 수 있다고 믿는다.
재료 및 방법
PD-L1 mAb 접합 PTX/TQD 적재 나노리포좀 제조
란 포스파티딜콜린(EPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG), DSPE-PEG2000-말레아마이드(DSPE-PEG2000-Mal)를 클로로포름 용액에서 3/2/0.5/0.25 몰비로 PTX, TQD와 함께 혼합한 후 회전증발기로 유기 용매를 증발시키고 3시간 동결건조했다. 지질 막을 pH 7.0에서 유지된 250mM 황산암모늄 용액으로 수화했다. 대형 다중막 리포좀을 65°C에서 유지된 욕조형 초음파기(Branson ultrasonicbath, USA)로 30분간 초음파 처리했다. 리포좀을 대량의 증류수에 대해 엄격히 1시간 동안 투석하여 자유 약물과 초기 성분을 교환했다. 리포좀을 인산완충염수(PBS, pH 7.4)에 재분산시켰다. PD-L1 mAb를 리포좀과 8:1(리포좀:mAb) 비율로 혼합하여 4°C에서 4시간 배양하여 리포좀에 접합시켰다. PD-L1 mAb는 항체의 설프하이드릴 잔기와 리포좀의 C-말단 말레아마이드 기 사이의 상호작용으로 DSPE-PEG2000-Mal에 접합된다. PD-L1 접합 리포좀을 10,000rpm으로 10분 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS 완충액에 재분산시켜 4°C에서 보관하여 추가 분석까지 진행했다. 리포좀에 캡슐화된 PTX와 TQD 양은 HPLC 법으로 평가했다. Agilent Technologies HPLC 시스템 모델 1260 Infinity(자동 시료 주입기 및 G1315D 다이오드 어레이 검출기 장착)를 사용했다. 이동상은 아세토니트릴/물(70:30 v/v) 혼합물로 1ml/min 유속으로 유지했다. C18 컬럼(5μm, 150×60mm, ODS-3)을 사용하여 시료를 용리하고 227nm에서 검출했다. 분석 전 PTX/TQD 적재 리포좀을 아세토니트릴에 용해하고 15분간 볼텍싱, 0.45μm 필터로 여과한 후 10μl 분취량을 HPLC 컬럼에 주입했다.
크기 분포 및 입자 형태 분석
약물 적재 제형의 크기 분포와 제타 전위는 25°C에서 Malvern 제타사이저(UK)로 측정했다. 실제 실험 전 나노입자 분산액을 증류수로 10배 희석하고 90° 검출 각도에서 3회 반복 측정했다. 나노입자 형태는 투과전자현미경(TEM)으로 평가했다. 나노입자 분산액을 증류수로 10배 희석하여 탄소 코팅 구리 그리드에 올리고 IR 램프로 건조한 후 요오드화 우라닐(1% w/v)로 염색하여 TEM(CM 30, Philips, Eindhoven, The Netherlands)로 평가했다.
방출 프로파일 분석
나노리포좀으로부터 PTX와 TQD의 방출 프로파일은 투석법으로 평가했다. 이를 위해 PD-L1 mAb 접합 PTX 및 TQD 적재 나노리포좀(PD-PTLP) 동결건조 분말 15mg을 증류수 1ml에 용해하고 투석막(MWCO 3.5kDa)에 밀봉하여 37°C에서 유지된 30ml 각 방출 완충액에 담갔다. 예정 시간에 시료 분취량을 채취하고 동량의 방출 완충액으로 대체했다. 연구를 72시간 지속했다. 시료를 0.22μm 주사기 필터로 여과하여 HPLC 컬럼에 주입하고 위 방법으로 평가했다.
세포 내화 연구
SGC7901/ADR 세포를 10% FBS, 100IU/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM)에서 5% CO₂, 37°C 조건으로 배양했다. 공초점 레이저 주사 현미경(BX61WI; Olympus, Tokyo, Japan)으로 SGC7901/ADR 세포에서 PTLP와 PD-PTLP의 세포 분포와 내화를 평가했다. 이를 위해 웰당 1×10⁵ 세포를 12웰 플레이트에 파종하고 18시간 배양했다. 세포를 PTLP와 PD-PTLP에 노출시키고 3시간 배양했다. 세포를 차가운 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 10분 고정했다. 다시 PBS로 세척하고 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 10분 염색했다. 마지막으로 세포를 조심스럽게 세척하고 CLSM으로 관찰했다. PD-PTLP 내화의 경쟁 실험은 자유 PD-L1 mAb로 세포를 30분 전처리하고 세척하여 수행했다. 세포를 자유 PD-L1 mAb 처리 그룹과 비처리 그룹 두 그룹으로 나누었다. 세포를 PD-PTLP로 배양하고 3시간 배양한 후 동일한 방법으로 세포 내화 분석을 수행했다.
웨스턴 블롯 분석에 의한 단백질 발현
SGC7901/ADR 세포를 6웰 플레이트에 웰당 3×10⁵ 세포/웰 밀도로 파종하고 18시간 배양했다. 세포를 각 제형(PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP)으로 처리하고 24시간 배양했다. 세포를 세척하고 스트리핑 버퍼로 추출한 후 표준 라이시스 버퍼(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 용해시켰다. 세포를 12,000rpm으로 15분 원심분리하고 상층액을 수집하여 BCA 단백질 분석법(Beyotime)으로 단백질 정량을 수행했다. 동량의 단백질을 8% SDS-PAGE 겔에 로딩한 후 니트로셀룰로오스 막(EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전이시켰다. 막을 5% 탈지분유로 1시간 차단하여 비특이적 결합 부위를 억제했다. 막을 1차 항체(P-gp 및 GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, USA)와 4°C에서 하룻밤 배양했다. 막을 TBST로 세척하고 다시 2차 항체(래비트 또는 마우스, 1:10,000, Abcam, MA, USA)인 과산화효소 표지 항래비트 또는 항마우스 항체와 실온에서 배양했다. 막을 다시 TBST로 세척했다. 블롯을 향상된 화학발광법(EMD Millipore)으로 시각화했다.
체외 세포독성 분석
개별 약물과 제형의 세포독성 효과는 MTT 분석법으로 평가했다. 간단히, 암세포를 96웰 플레이트 웰당 1×10⁴ 세포/웰 밀도로 층화하고 18시간 배양했다. 세포를 자유 PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP로 각각 24시간 처리했다. 다음, 세포를 조심스럽게 세척하고 5mg/ml MTT 용액 15μl를 첨가하여 3시간 추가 배양한 후 100μl DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 추출했다. 결과 흡광도를 자동 마이크로플레이트 리더로 570nm에서 측정했다. 세포 생존율은 시험군 OD/대조군 OD × 100%로 계산했다. 조합 지수는 Calcusyn™ 소프트웨어로 평가했다. 모든 실험은 3회 반복 수행했다.
체외 세포 사멸 및 활성산소종 분석
세포 사멸 분석을 위해 암세포를 12웰 플레이트 웰당 2×10⁵ 세포/웰 밀도로 층화하고 18시간 배양했다. 세포를 자유 PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP로 각각 24시간 처리했다. 세포를 스트리핑으로 추출하고 원심분리하여 펠릿을 100μl 결합 버퍼에 재분산시켰다. 세포를 5μl Annexin-V/FITC와 2.5μl PI 작동 용액 조합으로 공동 염색하고 15분 배양했다. 염색된 세포를 유세포분석기(BD FACS Calibur, BD Biosciences, CA, USA)로 분석했다. Annexin-V와 PI는 각각 살아있는 세포와 죽은 세포의 구조적 성분에 기반한 초기 세포 사멸 지표와 후기 세포 사멸 지표를 나타낸다.
2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 활성산소종(ROS) 분석용 프로브로 사용했다. 정량 분석을 위해 웰당 1×10⁴ 세포를 96웰 검은 바닥 플레이트에 파종하고 18시간 배양했다. 세포를 자유 PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP로 각각 24시간 처리했다. 세포를 PBS 버퍼로 세척한 후 제조사 지침에 따라 1ml DCFH-DA 용액으로 30분 배양했다. 세포를 용해시키고 10,000rpm으로 15분 원심분리했다. 결과 상층액을 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 자동 마이크로플레이트 리더로 485nm에서 형광을 측정했다. 동시에 별도 세포 세트를 유사하게 처리하고 형광 현미경(Nikon A1, Japan)으로 이미지를 관찰했다.
이종이식 모델에서 PD-PTLP의 항종양 효능
항종양 효능 연구는 BALB/c 누드 마우스에서 수행했으며 하빈의과대학 제4부속병원 실험동물센터에서 입수했다. 모든 동물 실험은 실험동물 품질 국가 표준에 따라 수행되었다. 실험은 하빈의과대학 제4부속병원 실험동물위원회 지침에 따라 엄격히 수행되었다. 동물을 오른쪽으로 150μl 배양액에 1×10⁶ SGC7901/ADR 세포를 피하 주사했다. 실제 실험 전 종양이 100mm³까지 자라도록 했다. 마우스를 5개 그룹으로 동일하게 나누고 각 그룹에 8마리씩 배정했다. PTX와 TQD 개별 용량은 5mg/kg으로 고정했으며 병용 시 총 용량 5mg/kg을 사용했다. 꼬리정맥 주사를 3일마다 총 3회 수행했다. 예정일에 종양 부피와 체중을 측정했다. 종양 부피는 디지털 캘리퍼로 종양의 최장 직경과 최단 직경을 측정하여 계산했다. 종양 부피(V) = ½ × 길이 × 너비²(mm²). 연구 종료 시 마우스를 희생시키고 종양을 추출하여 무게를 측정했다. 종양을 면역조직화학(IHC) 분석에 사용했다. 종양을 추출하여 얇게 썰고 10% 포르말린 용액에 고정했다. 종양을 파라핀 왁스에 포매한 후 제조사 지침에 따라 TUNEL 분석을 수행했다.
혈청 생화학 분석
마우스에 각 제형을 투여한 후 24시간 뒤 희생시키고 대조군 및 시험 처리 그룹에서 혈액 시료를 채취했다. 혈청을 전혈에서 분리하여 -80°C에 보관하여 추가 분석까지 진행했다. 혈청 생화학 분석을 수행하여 간 기능을 평가했다. 아스파테이트 아미노전이효소(AST)와 알라닌 아미노전이효소(ALT)를 측정하여 간 기능을 평가했다. 모든 측정은 생화학 키트 분석 절차에 따라 수행했다.
결과 및 논의
PTX/TQD 적재 PD-L1 접합 나노리포좀의 제조 및 특성 분석
PTX는 임상에서 널리 사용되며 주로 위암 치료에 적응된다. 그러나 대부분의 환자는 위암의 다약제 내성(MDR)으로 인해 낮은 치료 반응을 겪는다. PTX 용량 증가는 전신 독성 증가를 초래하여 MDR이 성공적인 암 치료의 주요 장애물이 되었다. 다양한 MDR 메커니즘 중 P-gp 매개 약물 유출이 암세포 약물 내성의 주요 원인으로 여겨진다[27]. 따라서 본 연구에서는 두 번째 약물(TQD)을 P-gp 억제제로 사용하여 암세포의 MDR 현상을 극복하고 PTX의 항암 효능을 개선했다. 두 약물이 시너지 효과를 나타내는 중량비를 신중히 연구했다. 항암 효과를 극대화하기 위해 다중 약물을 단일 나노입자 시스템에 공동 전달하는 것이 중요하다. 두 약물(PTX와 P-gp 억제제)을 동시에 전달하면 약물 유출 메커니즘을 효율적으로 억제하고 암세포 내 세포 내 약물 농도 증가 전망을 높일 수 있다[28]. 이를 위해 본 연구에서는 전신 순환에서 극도로 안정적인 것으로 여겨지는 나노리포좀의 지질 이중층에 두 약물을 적재했다(그림 1). 종양 특이적 표적화를 강화하기 위해 나노리포좀 표면을 PD-L1 mAb로 접합시켰다. 나노리포좀의 말레아마이드 기가 PD-L1 mAb의 티올 기와 결합하여 안정한 공유 결합을 형성한다. 그러나 말레아마이드 접합의 가능한 한계는 반응이 가역적이라는 점이다: 생성물이 혈장의 생물학적 티올과 역-마이클 첨가 반응을 거쳐 말레아마이드 방출을 초래할 수 있다. 그러나 우리는 말레아마이드-리포좀에 항체를 최대 표면 접합하여 이러한 반응을 극복했다. 종양 표적 리간드가 치료 부하를 종양 조직에 특이적으로 전달하여 정상 조직에서 불필요한 부작용을 피함이 보고되었다. 앞서 Patel 등은 P-gp 억제제와 PTX 결합이 체외 조건에서 난소암 세포의 MDR을 극복할 수 있다고 보고했다[11]. 마찬가지로 Zou 등[29]과 Zhang 등[30]은 타리퀴다르 존재 하에서 PTX의 SKOV-3TR 및 A2780-Adr 다약제 내성 세포에 대한 세포독성이 유의하게 증가함을 보고했다. 그러나 이들 연구에서는 PTX+TQD 물리적 병용 또는 비표적 전달체 개발이 사용되었다. 중요하게도 이 모든 연구가 체외 조건에서만 수행되었다. 본 연구는 비교적 새로운 표적제인 PDL1 항체를 사용한 표적 나노캐리어 설계에 초점을 맞췄다. 게다가 본 연구는 이종이식 종양 모델에서 PTX+TQD의 효능을 입증하고 혈액 매개변수 평가를 통해 전신 독성과 연관시켰다.
파클리탁셀과 타리퀴다르의 PD-L1 단일클론 항체(mAb) 표면 접합 나노리포좀 적재 개략도. 리포좀은 얇은 지질 막 수화와 초음파 처리로 약물 적재 나노리포좀을 형성함
PTLP의 평균 입자 크기는 135.6±1.26nm였으나 PD-L1 mAb 접합 후 168.59±1.34nm로 증가했다(PD-PTLP). PD-L1 mAb의 큰 분자량으로 인해 입자 크기가 증가했으나 전체 크기 200nm 미만과 구형 모양이 주목할 만하다(그림 2a). 200nm 미만 나노입자는 향상된 투과성 및 보유(EPR) 효과로 종양 조직에서 더 높은 축적을 허용한다. 또한 PEG 존재로 전신 순환에서 연장된 혈액 순환 시간을 허용한다. PD-PTLP의 제타 전위는 22.1±1.21mV로 혈액 성분과의 비특이적 결합을 방지한다. PD-PTLP는 두 약물(PTX와 TQD) 모두에 대해 ~95%의 높은 포집 효율을 보였다. PD-PTLP는 PTX와 TQD 각각에 대해 12~14% w/w의 높은 약물 적재량을 보였다(그림 2b).
PTX/TQD 적재 PD-L1 접합 나노리포좀의 물리화학적 특성 분석. a 투과전자현미경(TEM)을 이용한 PD-PTLP 형태 분석. b PD-PTLP 약물 적재 용량. c 37°C에서 pH 7.4 완충액과 pH 5.0 완충액 조건에서 PD-PTLP로부터 PTX와 TQD의 체외 방출. **p<0.01은 pH 7.4와 pH 5.0 완충액 간 약물 방출의 통계적 차이
체외 약물 방출
PD-PTLP로부터 PTX와 TQD의 방출 거동을 37°C에서 pH 7.4와 pH 5.0 조건으로 연구했다. 그림 2c와 같이 연구 기간(72시간) 내내 PD-PTLP로부터 약물(PTX와 TQD)의 제어된 방출이 관찰되었다. 나노리포좀의 두꺼운 이중층으로부터의 약물 방출이 두 약물의 느리고 지속적인 방출을 초래한 것으로 보인다. PTX와 TQD의 방출 패턴에 pH 7.4와 pH 5.0에서 유의한 차이가 관찰되지 않았음에 유의해야 한다. 더 긴 시점에서 다른 pH 조건에서 방출의 유의한 차이가 관찰되었다. 나노리포좀에 pH 반응성 요소가 추가되지 않았으며 산성 조건에서 더 높은 약물 방출은 낮은 pH에서 더 높은 확산에 기인할 수 있다. 예를 들어 pH 5.0 조건에서 ~85% PTX가 방출된 반면 생리적 pH 환경에서는 ~55% 약물 방출되었다. 산성 조건에서 작은 분자의 빠른 방출과 염기성 pH 조건에서 느린 방출의 유사한 패턴이 다른 연구자들에 의해 입증되었다. 그럼에도 불구하고 pH 7.4 조건에서 상대적으로 낮은 약물 방출은 불필요한 전신 부작용을 줄이고 전신 순환을 연장할 수 있으며 pH 5.0에서 더 높은 약물 방출은 종양 조직에서 더 높은 치료 효능에 이롭다.
체외 세포 내화 분석
표적(PD-PTLP)과 비표적(PTLP) 나노리포좀의 전달 효율을 SGC7901/ADR에서 테스트했다. 세포 내화는 로다민-B를 형광 추적자로 사용하여 평가했다. 로다민-B는 세포 생물학적 상호작용이 없는 일반적으로 사용되는 형광체다. 핵을 파란색 DAPI로 염색하고 빨간색은 나노입자에서 기인한다. CLSM 데이터는 PD-PTLP가 비표적 PTLP에 비해 암세포에서 강한 빨간색 형광을 나타냄을 명확히 보여준다. PD-PTLP 처리 암세포에서 더 높은 빨간색 형광은 더 높은 나노입자 내재화에 기인한다(그림 3a). CLSM 데이터 결과는 세포막에 발현된 PD-L1 수용체가 나노리포좀 표면에 접합된 PD-L1 mAb에 의해 인식됨을 나타낸다. 비특이적 또는 수동적 내화 메커니즘이 PTLP 처리 암세포에서 명백했다. PD-L1 표적 특이성은 PD-L1 mAb 전처리 실험으로 추가 확인되었다. SGC7901/ADR 세포를 PD-L1 mAb로 전처리하고 30분 배양했다. 세포를 PD-PTLP와 PTLP에 노출시키고 3시간 배양했다. 그림 3b와 같이 PD-L1 mAb로 전처리된 세포는 비처리 세포에 비해 유의하게 적은 빨간색 형광을 보였으며, 이는 PD-L1 mAb가 표면 발현 수용체에 소모되어 결합과 내재화를 위한 추가 수용체가 이용 불가능해져 나노입자 섭취 감소와 내재화 감소를 초래함을 나타낸다. 이러한 CLSM은 SGC7901/ADR 암세포에서 PD-PTLP의 표적 특이성을 명확히 드러냈다.
a PTLP와 PD-PTLP로 3시간 배양 후 SGC7901/ADR 세포의 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미지; PD-PTLP로 3시간 배양 후 PD-L1 mAb로 전처리/비전처리된 SGC7901/ADR 세포의 CLSM 이미지. 로다민 B를 형광 추적자로, DAPI를 암세포 핵 염색에 사용
이중 약물 적재 나노리포좀의 항증식 효과 향상
병용 요법을 위해 두 약물(PTX와 TQD)의 다양한 비율을 사용하여 내성 위암 세포에 대한 시너지 또는 첨가 효과 정도를 확립했다. 등효선도와 조합 지수(CI) 계산을 위해 CalcuSyn 소프트웨어(Biosoft, Version 2.1)를 사용했다. 등효선도는 Chou-Talalay 방정식 기반으로 설명될 수 있다. CI 값은 시너지(CI<0.9), 첨가(CI=1), 길항(CI>1)으로 특징지어진다. 그림과 같이 PTX와 TQD의 모든 조합 비율이 1 미만의 CI 값을 보여 시너지 작용 메커니즘을 의미한다(그림 4a). 구체적으로 PTX/TQD 중량비 1/0.5에서 최고 시너지가 관찰되었으며 TQD 중량비 증가에 따라 시너지 수준이 감소하여 두 약물이 특정 중량비로 존재함의 중요성을 나타낸다. 너무 낮거나 너무 높은 TQD 농도는 최적의 시너지 효과를 내지 못했다. 모든 체외 실험에서 P/T=1/0.5 비율을 사용했다.
a SGC7901/ADR 세포에서 PTX와 TQD의 다양한 중량비에 대한 조합 지수(CI). 조합 지수는 Calcusyn™ 소프트웨어로 평가. b 24시간 배양 기간 후 다양한 농도의 자유 PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP 처리 후 SGC7901/ADR 세포의 체외 세포 생존율. c 각 제형 처리 후 SGC7901/ADR 세포의 P-gp 발현 웨스턴 블롯 분석. **p<0.01과 ***p<0.001은 자유 PTX와 PD-PTLP 처리 그룹 간 통계적 차이
개별 및 병용 약물의 체외 세포독성 효과는 24시간 배양 후 MTT 프로토콜로 결정했다. 그림 4b와 같이 블랭크 NP는 세포 생존율에 영향을 주지 않아 최종 결과에 간섭 가능성을 배제했다. PTX와 TQD 단독 요법은 내성 위암 세포에서 농도 의존적 세포독성 효과를 보였으나 치료에 있어서 인상적인 효과에는 미치지 못했다. 두 번째 약물과 나노리포좀에 캡슐화되어 결합될 때 단일 제제의 항증식 효과가 현저히 개선되었다. PTX와 TQD의 병용은 단독 약물에 비해 명백한 시너지 효과를 나타냈다. 게다가 PD-L1 mAb 접합 나노리포좀(PD-PTLP)이 가장 강한 항증식 효과를 보여 나노입자 표면 표적 리간드의 영향을 입증했다. PD-L1 표적 처리 그룹에서 향상된 세포 사멸은 세포 내화 분석과 일치하게 SGC7901/ADR 세포에 의한 PD-L1 표적 나노리포좀의 높은 세포 내재화에 기인할 수 있다. PD-PTLP의 IC50 값은 0.76μg/ml로 PTX(6.58μg/ml)와 TQD(7.64μg/ml)에 비해 현저히 낮았다. PD-PTLP의 IC50 값이 10배 감소한 것은 P-gp 과발현 SGC7901/ADR에서 PTX 내성이 TQD에 의해 역전됨을 명확히 나타낸다. 체외 결과에서 TQD가 SGC7901/ADR 세포의 다약제 내성 역전에 효과적임이 입증되었다. 결과는 나노리포좀이 캡슐화된 약물의 약리학적 작용을 유지하고 암세포에서 제어된 방식으로 약물을 방출함도 보여준다. PTX와 TQD 병용 요법은 시너지 활성 증가로 항암 효능을 향상시켜 단독 요법의 최소 이점과 가능한 관련 부작용을 능가했다. 전반적으로 효과적인 P-gp 억제제와의 PTX 병용 치료가 나노리포좀에서 MDR을 극복하고 위암을 치료하는 유망한 전략이 될 수 있다.
분자 메커니즘 평가를 위해 SGC7901/ADR에서 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 그림 4c와 같이 PTX는 P-gp 단백질 발현에 영향을 주지 않았으나 반대로 TQD는 P-gp 발현을 유의하게 감소시켜 P-gp 억제제로서의 약리학적 역할을 확인했다. 흥미롭게도 PTLP와 PD-PTLP 같은 병용 약물 기반 제형은 TQD 처리 암세포에 비해 단백질 발현에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 결과는 단일 나노캐리어 시스템에 PTX와 TQD(P-gp 억제제)를 함께 적재하는 이점을 입증했다. 웨스턴 블롯 결과는 PTX+TQD 병용이 MDR을 역전시키고 위암 세포에서 더 높은 항암 효능을 나타냄과 세포 생존율 결과로 뒷받침될 수 있다.
유세포분석기를 이용한 세포 사멸 분석
개별 제형의 세포 사멸 분석은 유세포분석기를 이용한 Annexin V-FITC/PI 염색법으로 평가했다. 세포 사멸 결과는 그림 5a에 제시했다. 대조 세포는 세포 사멸 징후를 보이지 않았으나 자유 PTX와 TQD는 명백한 세포 사멸 세포 증가를 보였다. 병용 약물 기반 PTLP는 개별 약물에 비해 2배 높은 세포 사멸을 보여 제형의 시너지 항암 효과를 입증했다. 더 중요하게는 PD-PTLP가 약 60%의 세포 사멸 영역으로 암세포에서 가장 높은 세포 사멸을 보였다. PD-PTLP의 향상된 세포 사멸 효과는 이중 약물 적재 나노캐리어의 높은 내재화와 PTX와 TQD의 비율적 시너지 잠재력에 기인한다. 병용 요법에서 TQD의 P-gp 침묵 효과가 암세포에서 PTX의 항암 효과를 향상시켰다. 개별 약물의 세포 사멸률은 20~25% 범위였으나 PD-PTLP 처리 세포에서 약 60%의 세포 사멸 세포가 관찰되었다. PD-PTLP가 자유 약물과 비표적 리포좀보다 더 많은 세포 사멸을 유도하여 PD-L1이 PTX/TQD를 더 효율적으로 전달하여 SGC7901/ADR 세포의 세포 사멸을 유도함을 시사한다.
a Annexin V/PI 콤보 염색 후 유세포분석기를 이용한 SGC7901/ADR 세포 세포 사멸 분석. 세포를 2μg/ml 고정 농도로 처리. b 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브를 이용한 SGC7901/ADR 세포의 활성산소종(ROS) 분석. ***p<0.001은 자유 PTX와 PD-PTLP 처리 그룹 간 통계적 차이
세포 내 ROS 수준 결정
개별 약물과 이중 약물이 위암 세포의 산화환원 상태에 미치는 영향을 평가하기 위해 암세포의 활성산소종(ROS) 수준을 평가했다. 암세포 ROS 수준은 DCFH-DA(녹색 형광)로 평가했다. 정량적 ROS 데이터는 그림 5b에 제시했다. 비처리 세포는 ROS 징후가 없었으나 PTX나 TQD는 상당한 ROS 생성을 유도했다. 중요하게는 TPLP와 PD-TPLP가 자유 PTX나 TQD 또는 비처리 대조 세포에 비해 유의하게 높은 ROS 수준을 유발했다. 현저히 높은 ROS는 PD-TPLP가 더 높은 세포 사멸을 촉진할 잠재력을 나타낸다. 현미경 이미지는 정량적 결과와 일치하여 미처리 또는 자유 PTX, TQD 처리 암세포에 비해 가장 밝고 높은 강도의 녹색 형광을 보였다. 더 높은 녹색 형광 강도는 더 높은 ROS 생성을 나타낸다. ROS 같은 산화 스트레스는 세포 독성의 중요한 지표로 여겨진다. 연구에 따르면 ROS 유도는 DNA 손상, 염증, 세포 사멸 등 수많은 생리적 사건을 유도한다.
PTX와 TQD 병용이 약물 내성 종양 성장 억제
마지막으로 제형의 치료 효능과 독성 매개변수를 약물 내성 SGC7901/ADR 이종이식 종양 모델에서 조사했다(그림 6a). 약물을 5mg/kg 고정 용량으로 3일마다 정맥 투여하여 총 3회 주사했다. PTX/TQD는 1/0.5 고정 중량비로 투여했다. 예상대로 자유 PTX와 자유 TQD는 MDR 종양 성장에 억제 효과를 보이지 않아 SGC7901/ADR 세포가 MDR 종양 증식에 약물 내성을 나타냄을 시사한다. P-gp 억제제(TQD)는 약물 유출 펌프 억제에 효율적이나 치료 결과 개선으로 이어지지는 않는다. 비교하면 PTX+TQD 병용(PTLP)이 약물 내성 종양 성장을 유의하게 억제했다. 최고의 항종양 효능은 PD-PTLP에서 관찰되어 대조군 대비 3배, 자유 약물 대비 2.5배, 비표적 제형 대비 약 2배 효과적으로 종양 부담을 감소시켰다(p<0.05; p<0.001). 대조군, 자유 PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP의 최종 종양 부피는 각각 ~2000mm³, ~1650mm³, ~1625mm³, ~1000mm³, ~650mm³이었다. 자유 약물은 초기 시점에서 약간 효과적이었으나 비처리 대조군과 동일하게 성장했다. 결과는 PTX+P-gp 억제제 병용이 종양 부담을 효과적으로 제어하는 독특한 전략으로서의 잠재력을 명확히 드러낸다. PD-PTLP에서의 광범위한 종양 억제는 표적 제형 그룹의 더 큰 항종양 효능을 강력히 시사한다. 종양을 추출하여 무게를 측정했으며 종양 무게는 종양 부피 데이터와 일치했다(그림 6b). PD-PTLP 처리 마우스 그룹이 다른 제형 처리 그룹에 비해 가장 작은 종양을 보였다(p<0.001). 개별 종양의 억제 효과를 추가 검증하기 위해 종양을 TUNEL 분석에 사용했다(그림 6c). 그림과 같이 PD-PTLP는 비처리 대조군이나 자유 약물에 비해 광범위한 세포 사멸 염색을 보였다. PD-PTLP는 무질서한 세포 배열로 명백한 세포 사멸 특성을 보였다. PD-PTLP의 두드러진 종양 살해 효과는 약물 내성 종양 세포에서 더 큰 암세포 억제를 보여준다. PD-PTLP의 우수한 효능은 주로 표적 리간드(PD-L1 mAb) 존재에 기인하며, 이는 각각의 수용체와 결합하여 세포 내 농도를 증가시킨다. 병용 요법의 존재와 장기간 제어된 방출도 향상된 효능에 기여했다. 또한 조밀한 친수성 PEG 표면 코로나가 입자에 우수한 물리적 안정성을 제공하고 불필요한 단백질 흡착과 빠른 청소를 잠재적으로 회피할 수 있다. 긴 순환과 나노 크기 크기가 종양 조직에서 입자의 더 높은 축적에 이롭게 작용한다[31-33].
다약제 내성(MDR) SGC7901/ADR 종양에 대한 다양한 제형의 체내 항종양 효능; a 종양 부피, b 종양 무게 분석, c 종양 조직 TUNEL 분석. 마우스를 5mg/kg 고정 용량으로 3회 투여 기간 동안 3회 투여. 세포 사멸 웰은 TUNEL 분석으로 평가. *p<0.05, **p<0.05(PTLP vs PD-PTLP), ***p<0.001(PTX vs PD-PTLP) 처리 그룹
전신 독성 분석
체중 변화는 전신 독성의 좋은 지표다. 그림 7a와 같이 자유 PTX 처리 마우스는 10일째 ~20% 체중 감소가 연구 말기에 원상 회복되었다. 5% 이상 체중 감소는 심각한 내부 독성을 유발하는 것으로 간주되며 20% 체중 감소는 자유 약물의 유의한 부작용으로 간주된다[31]. 반대로 PTLP나 PD-PTLP는 그러한 체중 감소를 유발하지 않았으며 마우스는 연구 기간 내내 건강하게 유지되어 나노리포좀의 안전성을 입증했다. 전신 독성 없이 향상된 항종양 효능을 가진 전달 시스템은 종양 치료에 매우 효과적이다. 나노입자 안전성은 효소 혈장 수준 측정으로 추가 연구했다. 각 제형 투여 24시간 후 아미노전이효소(AST, ALT) 혈장 수준을 측정했다(그림 7b, c). 그림과 같이 자유 PTX는 AST와 ALT 수준을 유의하게 증가시킨(p<0.01) 반면 PD-PTLP와 PTLP는 비처리 대조군과 유의한 차이가 없었다. AST는 심장, 신장, 간 등 장기 손상 시 혈청으로 방출되며 ALT는 간 손상 시 특이적으로 방출된다[34]. AST와 ALT 수준은 장기 손상의 특이적 지표로 작용하며 이 점에서 PD-PTLP가 안전한 전달체임이 입증되었다.
SGC7901/ADR 종양에서 개별 제형의 전신 독성 분석; a 마우스 체중 분석; b, c 전신 독성 매개변수로서 혈청 AST, ALT 수준 생화학적 평가. *p<0.05, **p<0.01은 자유 PTX와 PD-PTLP 처리 그룹 간 통계적 차이
데이터 및 재료 가용성
본 연구에서 생성되거나 분석된 모든 데이터는 이 게재된 논문과 보충 정보 파일에 포함되어 있다.
