안정성 및 항균 활성이 강화된 프레임워크에 탄소 점 조립

초록

탄소점(CD)은 활성 표면으로 인해 항균제로 널리 사용되었지만 일부 CD는 불안정합니다. 따라서 항균 활성과 같은 상대적 응용 프로그램은 장기간 사용에 대해 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 여기에서 우리는 열수 과정을 통해 청색 형광을 가진 CD를 합성합니다. 그 후, 폴리에틸렌이민은 CD를 CD 기반 프레임워크(CDF)로 조립하기 위해 적용되었습니다. CDF는 소광된 형광을 나타내었지만 주사 전자 현미경 및 제타 전위 조사에 기초하여 보다 안정적인 특성을 보였다. CD와 CDF 모두 그람 음성 대장균(E. coli ) 및 그람 양성 황색 포도상구균 (S. 아우레우스 ), 그러나 CDF는 더 나은 항균 성능을 나타내었고, S. 구균 30μg/mL의 최소 억제 농도로 완전히 억제될 수 있습니다. 이것은 CDF가 안정성과 항균 활성을 모두 확대한다는 것을 보여주며, 이는 실제 적용에 더 유망할 것입니다.

그래픽 개요

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소개

세균 감염은 인명에 심각한 위협이 되며, 세균을 살균할 수 있는 효과적인 의약품의 개발이 요구되고 있다[1]. 세균 감염의 치료를 위해 다양한 항생제가 사용되어 왔지만 항생제의 남용은 부작용 및 약물 내성 문제와 같은 다른 문제를 야기한다[2]. 항균성 고분자[3], 금속 나노물질[4], 탄소나노물질[5, 6]을 포함하는 나노물질은 기존 항생제[7]의 대안으로 사용되어 왔다. 약물 내성 및 독성 문제가 모두 완화되고 있습니다[8]. 최근 CD[9, 10]와 나노클러스터(NC)[11]는 생체 적합성[12], 활성[13], 그리고 초소형 크기로 인해 순환에 의해 쉽게 세척될 수 있기 때문에 세균 감염 퇴치에 잘 적용되고 있습니다. [14, 15]. 특히, 연구자들은 CD가 우수한 자유 라디칼 소거 능력을 보여 많은 기존의 항감염 약물보다 더 강력할 수 있음을 발견했습니다[16,17,18]. 그러나 일부 초소형 항균제는 더 큰 산화 표면적 때문에 안정성이 좋지 않습니다[19]. 장기간 사용하기 위해 박테리아 감염을 퇴치하기 위한 보다 효과적인 항균제를 개발하는 것이 매우 요망됩니다.

실용적인 적용에 대한 요구를 충족시키기 위해 항균제는 다음과 같은 특성을 가져야 합니다. (a) 우수한 안정성은 주변 환경에서 일정 시간 동안 변하지 않고 유지됩니다. (b) 우수한 생체 적합성 및 낮은 독성:(c) 높은 항균 활성. 더 큰 나노 물질은 더 안정적인 경향이 있지만 활성 표면적이 더 작기 때문에 항균 활성이 상대적으로 약할 수 있습니다. 소형 및 대형 나노물질의 약점을 모두 고려하여 단순히 폴리에틸렌이민(PEI)을 추가하여 소형 CD를 대형 CDF로 조립하는 것으로 보고합니다(그림 1). CD는 융합되지 않았지만 빌딩 블록으로 형태를 유지했습니다. 따라서 전체 CDF는 더 큰 크기를 나타내지만 CD의 활성 특성을 잃지 않으면서 보다 우수한 안정성을 보였다. 또한, 우리는 CDF가 그람 음성 대장균(E. coli ) 및 그람 양성 황색 포도상구균 (S. 아우레우스 ) 많은 CD가 그람 양성 박테리아만 박멸했지만 CD에 비해 광범위한 항균 성능을 나타냅니다[20]. 또한 CDF는 PC12 세포(쥐의 부신 수질의 갈색세포종에서 얻은 세포주)의 증식을 촉진하여 신경 회복 응용 분야에 큰 잠재력을 보여줍니다[21]. 이 연구는 작은 CD를 큰 CDF로 조립하는 것이 안정성을 향상시킬 뿐만 아니라 항균 활성을 확대함을 시사합니다.

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항균 활성이 강화된 PEI를 추가하여 CD를 합성하고 CDF로 조립하는 방식

자료 및 방법

재료 및 도구

X선 표면 광전자 스펙트럼(XPS)은 ESCALAB250Xi X선 표면 광전자 분광법(XPS) 기기에서 기록되었습니다. 투과 전자 현미경(TEM)은 200kV에서 작동하는 JEM-2100 현미경으로 수행되었습니다. F97 형광 분광기를 사용하여 재료의 형광을 얻었다. 박테리아 세포의 FDA/PI 염색은 Leica DFC450C 현미경을 사용하여 탭핑 모드에서 기록되었습니다. 형광 수명은 Nanolog 분광형광계(Horbia JY, Japan)를 사용하여 TCSPC(time-correlated single-photon counting) 시스템에서 측정되었습니다. 자외선-가시광선 분광법(UV-vis) 스펙트럼은 UV-1600 기기에서 얻습니다. 세균 이미징은 공초점 현미경(Olympus FLUOVIEW FV1000 c)으로 관찰했습니다. 모든 시약은 분석 등급이었습니다. 실험을 통해 탈이온수를 사용하였다. 세포 계수 키트-8은 Beyotime Biotechnology에서 입수했습니다.

CD 및 CDF 준비

L-시스테인(1.0g)을 10.0mL의 탈이온수에 용해시키고 잘 혼합했습니다. 그런 다음, 용액의 pH를 1.0M NaOH로 9.0으로 조정했습니다. 용액을 열수 반응기로 옮기고 160°C에서 24시간 동안 가열했습니다. 용액을 상온으로 냉각시킨 후, 생성된 용액을 투석백(MW 7000 컷오프)을 이용하여 하루 동안 투석하였다. 획득한 CD를 다음 특성화 및 실험에 사용했습니다. CDF 준비를 위해 1% PEI 40µL를 CD 1mL에 추가했습니다. 혼합물을 1시간 동안 두었습니다. CD 정제와 동일한 방법으로 투석하여 생성물을 정제하였다. HR-TEM 특성화를 위해 샘플을 소량으로 농축하고 실리카겔 컬럼으로 옮기고 메탄올과 디클로로메탄으로 용리하여 추가 정제 생성물을 얻었다.

독성 평가

PC12 세포를 96웰 플레이트에 12시간 동안 시딩한 다음 농도가 다른 CD 및 CDF와 함께 배양했습니다. 생존 가능한 세포의 수는 Cell Counting Kit-8 assay(CCK-8)를 사용하여 조사되었습니다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)(PBS 중 5mg/mL)를 1/10 배양 부피로 첨가하고 세포를 인큐베이터로 되돌렸습니다. 그 후, 상층액을 버리고 200 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 10분 동안 흔들어 결정을 용해했습니다. 490nm에서 흡광도는 Microreader(Varioskan LUX Multimode Reader)를 사용하여 측정되었습니다. 모든 흡광도 측정에는 블랭크 대조군 웰이 포함되었습니다.

항균 실험

이. 대장균 및 S. 구균 CD 및 CDF의 부재 및 존재 하에 37°C에서 250rpm으로 진탕하여 인큐베이션했습니다. 리소제니 브로스(LB) 배양액에서 박테리아 세포의 성장은 600nm 파장(OD600)에서 마이크로리더로 측정되었습니다. 블랭크 대조군으로 LB 배지를 사용하였다. OD600은 세포 밀도를 나타내며, 상대적인 세포 생존율은 물질이 있는 상태에서 배양된 박테리아 세포와 대조군(CD 또는 CDF가 없는 상태에서 박테리아 세포의 OD600) 간의 비교를 기반으로 계산되었습니다. 살아있는/죽은 박테리아는 FDA/PI 염색 프로토콜에 의해 평가됩니다[22].

Ros 반응성 산소 종(ROS) 감지

지침에 따라 2', 7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브를 사용하여 12시간 동안 CD 및 CDF로 처리하기 전과 후에 세균 세포에서 세포 내 ROS 생성을 측정했습니다. 형광은 488nm에서 여기와 함께 525nm의 방출 파장에서 감지되었습니다.

결과 및 토론

자료 특성

크기 조사

그림 2는 몇 시간 동안 공기에 노출된 후 상대적으로 낮은 배율(그림 2a0)과 높은 배율(그림 2b0)을 가진 CDF용 분말의 SEM을 보여줍니다. CDF가 잘 분포되어 있고 평균 ca. 25나노. CD는 TEM 및 AFM 연구(추가 파일 1:그림 S1)에 따라 단일 분산된 작은 크기를 보여야 하지만 이러한 작은 입자는 일정 시간 동안 공기에 노출된 후 SEM으로 관찰한 응집을 나타냅니다(추가 파일 1:그림 S2 ). 반면에 CDF는 주변 환경에 노출되었지만 형태를 유지했습니다. 이것은 얻은 CDF가 실제 적용에 더 유망하다는 것을 나타냅니다. CDF는 TEM에 의해 추가로 특성화되었습니다(그림 2b1). CDF는 작은 CD를 빌딩 블록으로 사용하는 조립 구조를 나타냄을 알 수 있습니다. 고해상도 투과 전자 현미경(HR-TEM)(그림 2b2) 분석은 CDF의 빌딩 블록이 흑연의 (100) 평면 격자에 해당하는 0.21nm의 d-간격을 갖는 격자 무늬를 나타냄을 보여주었습니다. 클래식 CD와 유사합니다[23,24,25]. 따라서 조립 CDF는 전체 대형 프레임워크와 내부 소형 빌딩 블록의 장점을 결합할 수 있는 CD의 기능을 잃지 않습니다.

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상대적으로 낮은 CDF에 대한 SEM(a0 ) 및 더 높은 배율(b0 ); TEM(b1 ) HR-TEM(b2 )의 CDF

제타 전위

제타 전위 조사는 분산 시스템에서 인접한 하전 입자 사이의 CD 및 CDF의 정전기 반발 정도를 측정하는 데 사용되었습니다(그림 3). CD의 제타 전위 피크는 주변 환경에 노출되어 잘 나타나지 않음을 알 수 있습니다. 게다가, 제타 편차가 큰 다중 제타 전위 피크가 얻어졌으며(표 1), 이는 CD가 상당히 불안정하고 반복할 수 없음을 나타냅니다. 반면에 CDF의 제타 전위 피크는 비교적 안정적인 범위에 집중되었습니다. 또한 세 번 측정한 결과 제타 편차가 훨씬 작아 CDF가 더 안정적이고 분산된 시스템에 더 높은 순도의 샘플이 있음을 알 수 있었습니다.

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CD의 제타 전위(a ) 및 CDF(b )

형광 속성

형광 방출 스펙트럼은 CD에서 CDF로의 조립 과정을 모니터링하는 데 사용되었습니다(그림 4). PEI의 적정으로 350nm에서 형광 방출이 점차적으로 소멸되었습니다(그림 4a). 그러나 유의미한 형광 스펙트럼 이동이 관찰되지 않아 응집이 발생하지 않았음을 나타냅니다. CDF의 조립 구조는 CD의 전체 크기를 변경하여 형광에 영향을 줍니다. 한편, 근처의 CD는 서로의 형광을 표시했습니다. 뿐만 아니라 표면 화학은 형광 특성에 중요한 역할을 합니다. CD 표면의 질소 원자와 황 원자는 에너지 트랩을 생성할 수 있습니다. CD의 밝은 형광성은 많은 카르보닐 및 아미노기가 있는 결함 표면에 기인합니다. PEI의 기능화 후 CDF의 표면은 성장하는 크기와 함께 형광을 소멸시키는 아미노 그룹에 의해 지배되었습니다. CD와 CDF의 형광 거동 비교는 TCSPC에 의해 추가로 조사되어 물질의 광 생성 전하 재조합 경로를 이해했습니다(그림 4b). 방출은 430nm에서 모니터링되었습니다. 형광 붕괴는 2성분 지수 맞춤이 필요했습니다. 시간 상수와 상대 진폭은 표 S1에 적합하고 요약되어 있습니다. CD의 지배적인 구성 요소의 수명은 2.45ns인 반면 다른 구성 요소의 수명은 7.47ns인 것을 알 수 있습니다. 반면 CD의 지배적인 구성 요소의 수명은 1.98ns인 반면 다른 구성 요소의 수명은 7.30ns였습니다. CD와 CDF 사이에 유의미한 수명 변화는 관찰되지 않았으며, 이는 또한 CDF로 조립하는 동안 CD의 특성이 실질적으로 변경되지 않았음을 나타냅니다[26].

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형광 방출 스펙트럼 a PEI의 적정으로서의 CD 및 수명 b CD 및 CDF용

독성

재료의 안전성 평가를 위해 CD 및 CDF가 PC12 세포에 미치는 독성을 조사합니다. 세포 생존율에 대한 물질의 영향을 조사하기 위해 MTT 분석을 수행했습니다(그림 5). CD 및 CDF와 함께 PC12를 배양한 후 세포 생존율은 24시간 이내에 크게 영향을 받지 않았습니다. 흥미롭게도 두 탄소 재료는 신경 손상 치료에 중요한 역할을 하는 PC12의 증식을 촉진합니다. 이러한 결과는 물질의 낮은 독성을 나타내며 물질은 관련된 PC12 세포와 함께 신경 보호에 유망합니다[27].

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CD가 있는 상태에서 PC12의 세포 생존력(a ) 및 CDF(b ). 세포생존율(%) =(실험군의 흡광도-blank군의 흡광도)/(대조군의 흡광도-blank의 흡광도) × 100%

항균 조사

CD와 CDF의 항균 활성은 초기에 600nm에서 이들 약제의 존재 하에 세균 밀도를 측정하여 평가되었습니다[28]. 그림 6은 S에 대한 CD와 CDF의 실질적인 항균 효과를 보여줍니다. 구균 및 E. 대장균 세포. 특히, S의 생존 가능성. 구균 30µg/mL 이상의 CDF를 사용했을 때 세포는 거의 0이었습니다. 유사하게, E. 대장균 세포는 CD와 CDF 모두에 의해 소독되었습니다. CD는 여러 번 청구된 것으로 나타났습니다(그림 3a). 반면에 CDF는 미미한 전하를 띠고 있어(그림 3b) 약한 반발하에서 세균 부착을 억제하여 세균 표면과 더 쉽게 상호작용할 수 있습니다. 이에 비해 CDF는 6µg/mL 이상의 물질을 사용하면 상대적으로 더 많은 비율의 세포가 사멸되는 현상을 기반으로 더 높은 항균 활성을 보입니다. CDF의 향상된 항균 활성은 보다 안정적인 표면 전하뿐만 아니라 빌딩 블록으로서의 CD의 시너지 효과에 기인할 수 있습니다. 항균 메커니즘을 깊이 이해하기 위해 비형광 DCFH를 형광 DFC로 산화시킬 수 있는 ROS를 측정했습니다(그림 6C). 두 탄소 재료는 E 처리 후 ROS 생성을 유의하게 유도하지 않았습니다. 대장균 . 그러나 CDF는 S와 상호 작용하면서 세포 내 ROS를 현저하게 향상시켰습니다. 구균 . ROS는 세균의 DNA, RNA, 단백질에 손상을 줄 수 있기 때문에 그 가치를 높여 세균의 살균을 용이하게 합니다. 또한, ROS는 H₂로 자극되었습니다. O_2. H₂에 비해 ROS 제작이 모두 극적으로 승격되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다. O₂ 치료 단독, CDF는 가장 높은 향상을 보였다. 이것은 H₂의 조합을 나타냅니다. O₂ 이 두 탄소 재료를 사용하면 특히 CDF에 대한 항균 활성이 더욱 향상될 수 있습니다.

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S에 대한 CD 및 CDF의 항균 활성 구균 (아 ) 및 대장균 (b ), ㄷ H₂의 부재 및 존재하에서 CD 및 CDF의 처리와 함께 ROS 수준과 선형 관계를 나타내는 525nm에서 DCF의 형광 강도 O₂ (100μM)

일부 CD는 이전에 S를 소독하는 것으로 보고되었습니다. 구균 , 비교를 위해 표 2에 나열되어 있습니다. 현재 CDF는 경쟁력 있는 MIC를 보여주었습니다. 게다가, CDF는 조사된 세포 생존력을 감소시킬 뿐만 아니라 PC12의 세포 증식을 촉진하여 박테리아 감염을 치료하는 동안 다용성을 나타냅니다.

CD 및 CDF 처리 후 세균막의 무결성은 살아있는/죽은 염색 실험에 의해 조사되었습니다(그림 7). 녹색 형광성 FDA 염색은 살아있는 세포만 보여줄 수 있는 반면, 적색 형광성 PI는 손상된 막으로 죽은 박테리아를 특이적으로 염색하지만 온전한 박테리아 막이 있는 살아있는 것은 염색되지 않는다[30, 31]. 형광 이미지에서 볼 수 있듯이 CD 처리된 샘플에서는 명백한 적색 형광이 나타났고 CDF 처리된 샘플에서는 훨씬 더 높은 밀도의 죽은 세포가 나타났습니다.

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FDA/PI 염색 S. 구균 및 E. 대장균 30 µg/mL의 CD 및 CDF가 없거나 존재하지 않는 경우. 스케일 바, 200µm

위의 비교에 기초하여 우리는 CDF가 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 세포를 모두 죽이는 데 유망하다고 결론지었습니다. 따라서 E. 대장균 및 S. 구균 30 µg/mL의 CDF 처리 전후를 SEM으로 특성화했습니다(그림 8). 그림 8a, c와 같이 CDF 처리 전의 세균은 규칙적인 표면을 보인다. 그러나 CDF와 함께 배양한 후 S. 구균 (그림 8b) 대장균 (그림 8d)가 크게 변경되었습니다. 게다가 많은 세균 세포의 막이 부서졌습니다. 부착된 CDF에서 유래한 박테리아의 표면에 약간의 작은 물질이 관찰되었습니다. 이것은 CDF가 막을 손상시켜 박테리아 세포를 소독할 수 있음을 나타냅니다[32].

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S에 대한 SEM 구균 (아 , b ) 및 대장균 전에 (a , ㄷ ) 및 이후(b , d ) 30µg/mL의 CDF로 처리합니다. 스케일 바:2µm

CD와 CDF는 모두 형광성이므로 소독이 진행되는 동안 세균 이미징을 위해 6µg/mL의 약제를 조사했습니다. S의 이미징 구균 그림 9에 나와 있습니다. 흥미롭게도 S의 이미징에 CD와 CDF를 모두 사용할 수 있음이 밝혀졌습니다. 구균 . 그러나 CDF는 명시야와 암시야에서 관찰되는 세균 세포가 거의 중첩되기 때문에 더 높은 흡수 효율을 보입니다. 한편, S의 일부만. 구균 세포를 CD로 염색했습니다. 또한, 박테리아 세포 밀도는 CDF 처리에 의해 더 작아졌으며, 이는 소독된 CDF를 나타냅니다. 구균 동일한 용량의 CD에 비해 더 효율적입니다. 이러한 결과는 또한 CDF가 다양한 박테리아 세포를 이미징하기 위한 대체 염료로 사용될 수 있음을 보여줍니다.

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